葡萄糖濃度波動對INS-1細胞胰島素分泌的影響

林 占 薛耀明 關美萍

1.廣東省惠州市中心人民醫院內分泌科，廣東 惠州 516001；2.南方醫科大學南方醫院內分泌代謝科，廣東 廣州 510515

高糖分為持續性高糖及波動性高糖，研究發現波動性高糖同樣可以導致嚴重的胰島素分泌功能的損傷[1-2]，其機制并未完全研究清楚。細胞ATP是近年來研究的熱點，近年來發現胰島素的分泌和胰島β細胞內的ATP含量關系密切[3-4]。本實驗擬用含不同葡萄糖濃度及是否含抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）的培養液干預INS-1細胞，通過比較持續性高糖及波動性高糖對ATP生成的影響及影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640-培養基購自GIBAO，胎牛血清購自上海微科生化試劑有限公司，N-乙酰半胱氨酸及ATP檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 INS-1細胞貼壁生長于含有10%胎牛血清、0.6 mol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1 mmol/L丙酮酸鈉、50 mol/L 2-巰基乙醇的普通RPMI 1640-培養基中，置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度孵箱中培養。

1.2.2 實驗分組 將INS-1細胞隨機分為正常糖組（5.5 mmol/L葡萄糖培養液培養）、持續高糖組（16.7 mmol/L葡萄糖培養液培養）、波動組（用16.7 mmol/L葡萄糖培養液培養2 h，再換5.5 mmol/L培養3 h，每天重復3次，夜間9 h維持在5.5 mmol/L的培養液中）、NAC+正常糖組、NAC+持續高糖組、NAC+波動組，后3組的培養基中均預先負載終濃度為1.0 mmol/L NAC，余干預措施相同，均干預72 h。每組5個培養皿。各組每日均同時更換培養基以保持相同的處理條件，培養基事先恒溫箱37℃水浴，以減少對細胞的損傷。

1.2.3 測定的指標及方法 分組干預結束后，用熒光素酶法檢定細胞ATP含量，分別用2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖各刺激INS-1細胞1 h，收集上清后放免法測定其胰島素分泌水平，分別作為基礎和高糖刺激下胰島素釋放，計算高糖刺激胰島素分泌/基礎胰島素分泌作為胰島素分泌能力結果。結果均以胰島細胞總蛋白校正。

1.3 統計學方法

數據用SPSS 13.0統計軟件進行處理，計量資料數據以均數±標準差（）表示，采用方差分析，各組內均數比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，若方差不齊采用Welch近似方差分析；多重比較采用LSD法（Least-significant difference test），兩兩比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度葡萄糖及抗氧化劑對INS-1細胞胰島素分泌水平的影響

六組基礎胰島素分泌（2.8 mmol/L葡萄糖刺激）差異無統計學意義（P＞0.05），高糖刺激胰島素分泌（16.7 mmol/L葡萄糖刺激）差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 六組INS-1細胞的基礎胰島素分泌及高糖胰島素分泌(，n=5）

表1 六組INS-1細胞的基礎胰島素分泌及高糖胰島素分泌(，n=5）

組別基礎胰島素分泌（2.8 mmol/L葡萄糖刺激）（μU/μg protein)高糖刺激胰島素分泌（16.7 mmol/L葡萄糖刺激）（μU/μg protein)正常糖組高糖組波動組NAC+正常糖組NAC+高糖組NAC+波動組F值P值6.21±0.73 5.89±1.18 5.85±1.04 6.12±0.84 5.93±0.84 6.03±0.89 0.115 0.988 22.91±2.18 16.55±2.13 12.73±2.48 22.41±3.05 19.71±2.01 19.50±2.51 13.365 0

2.2 不同濃度葡萄糖及抗氧化劑對INS-1細胞ATP含量及胰島素分泌能力的影響

由表2可知，與正常糖組相比，持續性高糖組及波動組的胞內ATP含量及胰島素分泌能力顯著下降（P＜0.01），且波動組下降更明顯。使用抗氧化劑NAC干預持續性高糖組及波動組，兩組的細胞ATP含量及胰島素分泌能力均較未使用組顯著增加（P＜0.05）。

3 討論

近年來，血糖波動的危害越來越受到關注，研究發現波動性高血糖不僅促進糖尿病慢性并發癥的發生和發展[5-7]，也可損傷β細胞的胰島素分泌功能[1-2]。本研究發現，波動性高糖及持續性高糖均可損傷INS-1細胞的胰島素分泌能力，且波動性高糖更嚴重。

已有研究發現，胰島β細胞胰島素分泌與ATP合成相偶聯[3-4]。葡萄糖刺激胰島素分泌的重要機制是葡萄糖增加ATP的合成，減少游離二磷酸腺苷，導致ATP敏感性K+通道關閉，細胞去極化，Ca2+通過鈣電壓門控通道內流，并產生一系列的級聯放大效應使胰島素分泌顆粒胞吐，胰島素分泌到細胞外[4]。本研究結果發現，ATP含量在持續性高糖組及波動組均較正常糖組顯著下降，且波動組下降更明顯。本研究提示，波動性高糖及持續性高糖可能通過降低INS-1細胞的ATP生成降低其胰島素分泌能力，且波動性高糖更嚴重。

表2 六組INS-1細胞ATP含量及胰島素分泌能力的比較（，n=5）

表2 六組INS-1細胞ATP含量及胰島素分泌能力的比較（，n=5）

注：與正常糖照組比較，■P＜0.01；與持續高糖組比較，▲P＜0.05；與波動組比較，◆P＜0.01

組別 ATP含量 胰島素分泌能力（nmol/mg protein） （高糖/基礎）正常糖組47.058±4.5353.702±0.277持續高糖組35.950±3.911■2.843±0.251■波動組28.816±3.772■▲2.188±0.265■▲NAC+正常糖組48.014±5.0183.668±0.214 NAC+持續高糖組41.624±3.543▲3.342±0.178▲NAC+波動組41.042±3.794◆3.246±0.195◆

高糖可引起胰島β細胞功能紊亂，胰島素分泌功能受損，其機制較復雜。近年來大量文獻證實氧化應激在β細胞的損傷中發揮的重要作用[8]。胰島β細胞系INS-1細胞株表達氧自由基清除酶少，對氧化應激損傷高度敏感，本實驗采用該細胞株進行研究。已有多篇文獻證實抗氧化劑NAC能夠保護胰島β細胞的分泌功能[9]，本研究用NAC處理后發現，NAC+波動組及NAC+持續高糖組的細胞ATP含量及胰島素分泌能力分別較波動組及持續高糖組顯著增加，抗氧化劑可以顯著改善細胞ATP及胰島素分泌能力，提示波動性高糖及持續性高糖導致ATP合成減少可能與氧化應激有關。

綜上所述，波動性高糖及持續性高糖可能通過氧化應激使ATP合成減少，且波動性高糖的程度更嚴重，最終導致INS-1細胞胰島素分泌功能的損傷。這為以后改善ATP合成以減少β細胞高糖毒性提供更多的理論依據。但波動性高糖及持續性高糖使ATP合成減少的許多具體機制仍未證實，有待進一步的研究。

[1]Hou ZQ，Li HL，Gao L，et al.Involvement of chronic stresses in rat islet and INS-1 cell glucotoxicity induced by intermittent high glucose[J].Mol Cell Endocrinol，2008，291(1-2)：71-78.

[2]Qiu P，Zhao TY，Li XJ， et al.Damage mechanism of intermittent exposure to high concentrations of glucose to beta cell lines(HIT-T15 cell)[J].Sichuan Da Xue Xue Bao：Yi Xue Ban，2008，39(1)：69-71，93.

[3]Maechler P，Wang H，Wollheim CB.Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase[J].FEBS Lett，1998，422(3)：328-332.

[4]Rutter GA.Visualising insulin secretion.The Minkowski Lecture 2004[J].Diabetologia，2004，47(11)：1861-1872

[5]Azuma K，Kawamori R，Toyofuku Y，et al.Repetitive fluctuations in blood glucose enhance monocyte adhesion to the endothelium of rat thoracic aorta[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(10)：2275-2280.

[6]Yano M，Hasegawa G，Ishii M，et al.Short-term exposure of high glucose concentration induces generation of reactive oxygen species in endothelial cells：implication for the oxidative stress associated with postprandial hyperglycemia[J].Redox Rep，2004，9(2)：111-116.

[7]Madsbad S，Brock B，Schmitz O，et al.Postprandial hyperglycemia.Postp-randial blood glucose fluctuations，cardiovascular disease and late diabetic complications[J].Ugeskr Laeger，2003，165(33)：3149-3153.

[8]Robertson R，Zhou H，Zhang T，et al.Chronic oxidative stress as a mechanism for glucose toxicity of the beta cell in type 2 diabetes [J].Cell Biochem Biophys，2007，48(2-3)：139-146.

[9]Tanaka Y，Gleason CE，Tran PO，et al.Prevention of glucose toxicity in HIT-T15 cells and Zucker diabetic fatty rats by antioxidants [J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(19)：10857-10862.