健脾祛瘀法對血脂異常小鼠視網膜色素上皮-玻璃膜-脈絡膜毛細血管復合體的影響

謝禮丹 曾慶華 莫 亞 唐春艷 劉小虎

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是一種與年齡相關的變性類疾病，以視網膜色素上皮層及脈絡膜的玻璃膜疣沉積（干性AMD），繼而引發病理性脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）（濕性 AMD）為臨床特征，可導致嚴重的中心視力損害〔1〕。該病的發病機制仍不十分清楚，與多種因素有關，比如動脈粥樣硬化，盡管二者之間的關系并不很清晰，但有研究認為這些多因素的復雜疾病可能有共同的通路，推測高血脂與AMD的發生有一定的聯系。我們的前期實驗證明，血脂異常可使載脂蛋白E缺乏（apolipoprotein E-deficient，ApoE-/-）小鼠的視網膜光感受器細胞、視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞及玻璃膜（Bruch’s membrane，BM）發生類似于早期年齡相關性黃斑變性的病理改變〔2〕（像動脈粥樣硬化病變一樣，BM脂質的來源并不是完全來自血液〔3-5〕）。 血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowth factor，VEGF）是在AMD進展過程具有重要作用的物質〔6〕，可通過刺激其 R2 受體（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）介導血管內皮細胞DNA合成和增殖，VEGFR2還參與由VEGF介導的血管通透性改變〔7-9〕。本課題擬觀察健脾祛瘀中藥對實驗性血脂異常小鼠的視網膜色素上皮-玻璃膜-脈絡膜毛細血管復合體（retinal pigment epithelium-Bruch’s membrane-choriocapillaris complex，RBCC）結構及VEGF、VEGFR2表達的影響，以探討中醫藥防治CNV的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡ApoE-/-雄性小鼠，體質量25.9～34.5 g，由北京大學實驗動物學中心提供（美國Jackson實驗室引進），動物合格證：川實動管質第09號。普通飼料及高脂飼料由成都達碩動物實驗有限公司提供，于四川省人民醫院清潔實驗室中采用獨立通風籠盒（independent ventilation cage，IVC）飼養。 所有實驗根據赫爾辛基宣言保護和運用動物的指導原則來進行。

1.2 造模與分組

8周齡小鼠予高脂飼料喂養至6月齡后，查總膽固醇（total cholesterol， TC）＞6.5 mmol/L 及三酰甘油（triacylglycerol，TAG）＞1.86 mmol/L 者為血脂異常模型造模成功，改予普通飼料飼養。將模型小鼠隨機分為低、中、高濃度給藥組及陰性對照組，每組12只。另設普食組小鼠12只，始終予普通飼料喂養至7月齡。

1.3 給藥方法

健脾祛瘀中藥主要由生蒲黃、丹參、牡丹皮、郁金、川芎等組成（四川綠色藥業科技發展股份有限公司）。按照動物與人的折算系數換算用藥劑量（成人體質量按60 kg計算），并以中劑量作為等效劑量，低、中、高劑量按照 1∶3∶9的比例計算，分別配制成0.06 g/ml、0.18 g/ml、0.54 g/ml的混懸液，按 1 ml/100 g灌胃給藥，每日2次；陰性對照組予等體積的生理鹽水灌胃，各組小鼠用藥1個月后處死。

1.4 觀測指標及測試方法

1.4.1 一般狀態觀察：觀察小鼠食欲、神態、反應能力、被毛、肌肉情況，每周進行小鼠體質量檢查。

1.4.2 小鼠血液生化檢測方法：禁食12 h后，在動物宰殺前注射鎮靜劑戊巴比妥鈉后股靜脈采血，采用日立7170全自動生化分析TC和TAG；R-80A血液黏度儀檢測全血黏度、紅細胞壓積。

1.4.3 組織形態學觀察：（1）光鏡觀察方法：處死動物后沿眼球顳側角鞏膜緣處剪開眼眶，摘除眼球，每組10只，共50只，保留約2～3 mm長度的視神經組織，放入4%多聚甲醛（PBS溶解）固定，常規乙醇脫水，石蠟包埋，于后極部視神經周圍切片，制成4～5μm組織切片，常規脫蠟脫水行Masson三色染色。奧林巴斯BX50彩色數碼攝像頭連續攝取切片彩色圖像，每個標本隨機選擇10幅圖像，采用Mias-2000型圖像分析系統進行分析，測量RPE厚度、Bruch’s膜厚度。每一標本均為100次測量（每幅圖像10次）的平均值。（2）電鏡觀察方法：摘除眼球方法同前，經30 ml/L戊二醛預固定，10 g/L四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及枸酸鉛染色，日本H-600IV型透射電鏡觀察。

1.4.4 RBCC中VEGF、VEGFR2表達的檢測：采用免疫組化方法。每組取10只左眼（與Masson三色染色為同一只眼球），于眼球后極部切成7μm厚的組織切片，涂上多聚-L-賴氨酸，經脫蠟和100%乙醇處理后，用3%過氧化氫液浸泡切片20 min去除內源性過氧化物酶活性，然后用70%乙醇再水合和PBS液清洗。標本經正常兔血清處理30 min以阻滯黏附的非特定抗體，再用鼠抗人VEGF及VEGFR2單克隆抗體在4℃溫度下孵育12 h。每張切片在視網膜后極部連續取5個視野，在奧林巴斯BX50光學顯微鏡200倍下觀察，運用Mias-2000型圖形圖像分析系統，測量RBCC層VEGF及VEGFR2的陽性表達總面積及積分光密度。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況

陰性對照組：進食減少，體胖懶動，被毛枯槁，無光澤，白毛叢生，肌肉松弛。藥物治療組：被毛漸生光澤，較治療前活潑好動，且體質量明顯低于陰性對照組（P＜0.05）（表 1）。

2.2 血脂及血液流變學

表1 載脂蛋白E缺乏小鼠治療后與其他各組的體質量比較（）

表1 載脂蛋白E缺乏小鼠治療后與其他各組的體質量比較（）

注：與陰性對照組比較，①P＜0.05；與普食組比較，②P＜0.05（單因素方差分析，LSD法）

組別 樣本量 體質量/g低濃度給藥組 12 31.96±1.16①中濃度給藥組 12 31.57±1.51①高濃度給藥組 12 31.726±1.27①陰性對照組 12 34.27±1.16②普食組 12 32.18±1.59

2.2.1 血脂：普食組及各藥物治療組的TC、TAG濃度均明顯低于陰性對照組（P＜0.05）（表 2）。

表2 載脂蛋白E缺乏小鼠治療后與其他各組的血脂濃度比較（，mmol/L）

表2 載脂蛋白E缺乏小鼠治療后與其他各組的血脂濃度比較（，mmol/L）

注：與陰性對照組比較，①P＜0.05；與普食組比較，②P＜0.05（單因素方差分析，LSD法）

組別 樣本量 總膽固醇 三酰甘油低濃度給藥組 12 7.63±0.46① 0.80±0.21①中濃度給藥組 12 6.67±0.52① 0.65±0.23①高濃度給藥組 12 6.47±0.49① 0.62±0.21①陰性對照組 12 10.53±0.30② 1.15±0.29②普食組 12 9.63±0.18 0.88±0.21

2.2.2 血液流變學：陰性對照組的血漿黏度、紅細胞壓積、全血低切黏度、全血高切黏度明顯高于普食組（P＜0.05）；中濃度給藥組血漿黏度明顯低于陰性對照組（P＜0.05），中濃度給藥組、高濃度給藥組紅細胞壓積、全血低切黏度、全血高切黏度明顯低于陰性對照組（P＜0.05）（表 3）。

表3 載脂蛋白E缺乏小鼠治療后與其他各組的血液流變學指標比較（）

表3 載脂蛋白E缺乏小鼠治療后與其他各組的血液流變學指標比較（）

注：與陰性對照組比較，①P＜0.05；與普食組比較，②P＜0.05（單因素方差分析，LSD法）

組別 樣本量 血漿黏度/mPa·s 紅細胞壓積 全血低切黏度/mPa·s 全血高切黏度/mPa·s低濃度給藥組 12 1.81±0.10 54.17±3.71 33.27±3.07 33.27±3.07中濃度給藥組 12 1.72±0.08① 52.17±2.86① 29.05±2.75① 5.06±0.24①高濃度給藥組 12 1.74±0.11 52.00±3.41① 30.08±3.98① 5.13±0.19①陰性對照組 12 1.85±0.11② 56.17±3.06② 34.61±3.66② 5.64±0.24②普食組 12 1.74±0.13 51.83±3.19 26.76±3.86 5.18±0.30

2.3 光學顯微鏡鏡觀察

RPE厚度：陰性對照組明顯低于普食組（P＜0.05），藥物治療組略高于陰性對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。 Bruch’s膜厚度：陰性對照組明顯高于治療組及普食組（P＜0.05）（表 4，圖 1）。

2.4 RBCC中VEGF、VEGFR2的表達

普食組及各藥物治療組VEGF、VEGFR2的陽性表達總面積和積分光密度均明顯低于陰性對照組（P＜0.05）；中濃度給藥組的 VEGF、VEGFR2 表達明顯低于低、 高濃度給藥組 （P＜0.05）（表5～表6，圖 2～圖3）。

表4 載脂蛋白E缺乏小鼠治療后與其他各組RPE厚度、Bruch’s膜厚度比較（）

表4 載脂蛋白E缺乏小鼠治療后與其他各組RPE厚度、Bruch’s膜厚度比較（）

注：與普食組比較，①P＜0.05；與陰性對照組比較，②P＜0.05（單因素方差分析，LSD法）。RPE：視網膜色素上皮

組別 樣本量 RPE厚度/μm Bruch’s膜厚度/μm低濃度給藥組 10 5.08±0.34① 0.89±0.09②中濃度給藥組 10 5.09±0.40① 0.90±0.09②高濃度給藥組 10 5.10±0.46① 0.90±0.05②陰性對照組 10 4.98±0.50① 1.02±0.13①普食組 10 7.53±0.99 0.89±0.11

表5 各組載脂蛋白E缺乏小鼠實驗結束時RBCC中VEGF 的表達情況（）

表5 各組載脂蛋白E缺乏小鼠實驗結束時RBCC中VEGF 的表達情況（）

注：與陰性對照組比較，①P＜0.05；與普食組比較，②P＜0.05；與中濃度給藥組比較，③P＜0.05（單因素方差分析，LSD法）。RBCC：視網膜色素上皮-玻璃膜-脈絡膜毛細血管復合體；VEGF：血管內皮生長因子

VEGF陽性表達積分光密度低濃度給藥組 10 71270±7115①③ 39368±5514①③中濃度給藥組 10 59945±3981① 33078±4519①高濃度給藥組 10 70137±5981①③ 39243±6106①③陰性對照組 10 81439±13732② 45811±7439②普食組 10 64032±11300 33493±5911組別 樣本量VEGF陽性表達總面積/μm2

表6 各組載脂蛋白E缺乏小鼠實驗結束時RBCC中VEGFR2 的表達情況（）

表6 各組載脂蛋白E缺乏小鼠實驗結束時RBCC中VEGFR2 的表達情況（）

注：與陰性對照組比較，①P＜0.05；與普食組比較，②P＜0.05；與中濃度給藥組比較，③P＜0.05（單因素方差分析，LSD法）。RBCC：視網膜色素上皮-玻璃膜-脈絡膜毛細血管復合體；VEGFR2：血管內皮生長因子的R2受體

VEGFR2陽性表達積分光密度低濃度給藥組 10 71977±8201①③ 39613±6436①③中濃度給藥組 10 61279±8778① 32731±4398①高濃度給藥組 10 71890±5873①③ 39434±4812①③陰性對照組 10 82782±14968② 46415±8844②普食組 10 64855±8358 35077±6665組別 樣本量VEGFR2陽性表達總面積/μm2

圖1 各組載脂蛋白E缺乏小鼠視網膜光學顯微鏡下所見（Masson三色染色×200）。1A.陰性對照組；1B.普食組；1C.低濃度給藥組；1D.高濃度給藥組；1E.中濃度給藥組。RPE厚度：陰性對照組明顯低于普食組；Bruch's膜厚度：陰性對照組明顯高于治療組及普食組圖2 各組載脂蛋白E缺乏小鼠視網膜VEGF表達情況（×200）。2A.陰性對照組；2B.普食組；2C:低濃度給藥組；2D.高濃度給藥組；2E.中濃度給藥組。普食組及各藥物治療組VEGF的陽性表達均明顯低于陰性對照組；中濃度給藥組的VEGF表達明顯低于低、高濃度給藥組。VEGF：血管內皮生長因子圖3 各組載脂蛋白E缺乏小鼠視網膜VEGFR2表達情況（×200）。3A.陰性對照組；3B.普食組；3C.低濃度給藥組；3D.高濃度給藥組；3E.中濃度給藥組。普食組及各藥物治療組VEGFR2的陽性表達均明顯低于陰性對照組；中濃度給藥組的VEGFR2表達明顯低于低、高濃度給藥組。VEGFR2：血管內皮生長因子的R2受體

2.5 RBCC的超微結構（圖4～圖6）

2.5.1 RPE：陰性對照組基底膜皺褶變短且減少，胞質內線粒體腫脹，可見核邊集及核固縮，以及次級溶酶體。胞漿內可見大量白色空泡（△所示）。普食組可見基底膜皺稀疏，胞質內個別線粒體腫脹，可見次級溶酶體，胞漿內少量白色空泡。低濃度給藥組基底皺褶排列整齊，胞質內線粒體結構清晰，可見次級溶酶體，大量色素顆粒，少量白色空泡。高濃度給藥組基底皺褶排列整齊，胞質內線粒體結構清晰，可見次級溶酶體，色素顆粒較少，少許白色空泡。中濃度給藥組基底皺褶排列整齊，胞質內線粒體結構清晰，可見次級溶酶體，色素顆粒明顯減少，未見白色空泡。

2.5.2 Bruch’s膜：陰性對照組較其它組增厚，可見大量半透明物沉積（☆所示），纖維結構減少，彈力層斷裂。普食組Bruch’s膜結構清晰，較為均勻，見少許半透明物沉積，纖維結構連續；低濃度給藥組Bruch’s膜結構清晰，較為均勻，少許半透明物沉積，纖維結構較連續。高濃度給藥組Bruch’s膜結構清晰，較為均勻，少許半透明物沉積，纖維結構較連續。中濃度給藥組Bruch’s膜結構清晰，較為均勻，未見半透明物沉積，纖維結構連續，厚度明顯較陰性對照組變薄。

2.5.3 脈絡膜毛細血管：陰性對照組見內皮細胞腫脹、變形，細胞核形態極不規則，異染色質邊集，內皮細胞間連接破壞，基底膜階段性增厚，管腔變窄。普食組的血管由一層連續的有窗孔的內皮細胞構成（箭頭所示），內皮細胞形態正常，線粒體輕度腫脹。各藥物治療組內皮細胞結構形態正常，基底膜規則，管腔正常，線粒體結構正常。

圖4 各組載脂蛋白E缺乏小鼠視網膜色素上皮（RPE）透射電子顯微鏡所見。4A.陰性對照組，胞漿內可見大量白色空泡；4B.普食組；4C.低濃度給藥組；4D.高濃度給藥組；4E.中濃度給藥組。BM：Bruch’s膜；△代表胞漿內空泡

圖5 各組載脂蛋白E缺乏小鼠Brush’s膜（BM）透射電子顯微鏡所見。5A.陰性對照組，可見大量半透明物沉積；5B.普食組；5C.低濃度給藥組；5D.高濃度給藥組；5E.中濃度給藥組。☆代表半透明物沉積

圖6 各組載脂蛋白E缺乏小鼠脈絡膜毛細血管層（CC）透射電子顯微鏡所見。6A.陰性對照組；6B.普食組，血管由一層連續的有窗孔的內皮細胞構成（→所示）；6C.低濃度給藥組；6D.高濃度給藥組；6E.中濃度給藥組。☆代表半透明物沉積

3 討論

AMD屬于黃斑疾病，根據陳達夫黃斑屬足太陰脾經的理論，本病的發病與脾臟的功能異常有關。曾慶華等〔10〕對本病的病位和臟腑歸屬進行了更為深入的分析，認為本病“標”在黃斑屬脾胃，“本”在黃斑之下的脈絡膜屬少陰心腎，病位在脈絡膜毛細血管復合體等組織。該組織既富有心所主的血脈，又富有腎所主的色素，而黃斑色黃屬脾，故本病與脾腎心三臟密切相關。就病機特點而言，AMD證屬本虛標實，虛為脾腎虛衰、氣血不足，實為痰瘀同病、痰瘀互結；病機關鍵是痰瘀同病，故在施治時應重視化痰祛瘀，這也是中醫治療AMD痰瘀互結致病的必要手段，但治療痰瘀膠結的著眼點仍是辨證，以便能更精確地把握機體某一階段的病理，達到事半功倍的效果〔11〕。本課題吸收陳達夫及曾慶華教授的理論，以健脾祛瘀法循經選藥擬定黃斑康方來治療AMD，該方由生蒲黃、川芎、丹參、牡丹皮、郁金等中藥組成，化痰祛瘀，并具有改善血脂、血液流變學指標，以及抗氧自由基的綜合作用〔12〕。

本實驗中，血脂異常模型小鼠經健脾祛瘀藥物治療后，其體質量、血脂、血液流變學指標均較陰性對照組明顯降低，RBCC的病理改變也輕于陰性對照組。治療組RPE基底皺褶排列整齊，線粒體結構清晰，可見次級溶酶體，未見大量空泡出現；Bruch’s膜結構清晰；脈絡膜毛細血管內皮細胞結構形態正常，基底膜規則，管腔正常。這可能與藥物清除了血液中的脂質，阻止脂類物質進入細胞線粒體，減少氧自由基數量，并改善Bruch’s膜代謝產物轉運有關。但因RPE不可再生，治療組的RPE雖較陰性對照組稍厚，其差異卻無統計學意義。

Katrina Spilsbury〔13〕等實驗發現，大鼠 RPE 細胞VEGF的暫時性高表達會引起脈絡膜新生血管的形成。VEGF是內皮細胞特異性的有絲分裂因子，可誘導內皮細胞的增殖、移遷，刺激VEGFR2介導新生血管內皮細胞DNA合成和增殖。VEGFR2是VEGF的主要功能受體，它作為一種酪氨酸激酶受體與VEGF結合，形成二聚體及酪氨酸發生自身磷酸化，激活并將細胞膜/細胞質激酶級聯反應信號傳遞到細胞核，引發內皮細胞的一系列變化，促進新生血管形成并維持其完整性。VEGFR2還參與由VEGF介導的血管通透性改變〔7-9〕，下調VEGF的表達可以阻斷VEGF/VEGFR2信號傳導通路。本實驗通過免疫組化方法檢測小鼠RBCC中VEGF、VEGFR2的表達，結果藥物治療組的VEGF及VEGFR2表達較陰性對照組明顯減少，中濃度給藥組的VEGF、VEGFR2表達較低、高濃度給藥組低，說明中劑量的健脾祛瘀方在一定程度上抑制了血脂異常小鼠RBCC上VEGF及VEGFR2表達。

綜上所述，健脾祛瘀中藥可減輕實驗性血脂異常小鼠RBCC的病理性損害，一定程度上下調RBCC中VEGF、VEGFR2的表達，并可改善模型動物體質量、血脂和血液流變學指標，這可能是其預防和治療CNV的作用機制。

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