右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐制備 特微分子右旋糖酐

許朝芳，張麗娟，阮 恒，李致寶，韋少平，柯 敏，曾練強(qiáng)

（1.廣西化工研究院，廣西 南寧 530001；廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東 廣州 510316）

小分子右旋糖酐又稱右旋糖酐20，其重均分子量為16000～24000Da，而特微分子右旋糖酐的重均分子量則為 3000～6000Da。

右旋糖酐鐵注射液是目前國內(nèi)外公認(rèn)較好的仔豬補(bǔ)鐵針劑，通過在仔豬出生后1～4d內(nèi)一次性肌肉注射1mL鐵含量為150mg·mL-1的右旋糖酐鐵注射液，可滿足仔豬整個(gè)哺乳期對鐵的需要，預(yù)防仔豬缺鐵性貧血，促進(jìn)仔豬生長，降低仔豬死亡率。但目前國內(nèi)生產(chǎn)的右旋糖酐鐵注射液的重均分子量均較大，多為7000～24000Da，這對肌注后機(jī)體對藥品的吸收極為不利，多造成注射部位有黑色的壞死灶而影響豬的胴體質(zhì)量。而從歐洲進(jìn)口的某品牌的右旋糖酐鐵注射液的重均分子量為3000～6000Da，是目前國內(nèi)外公認(rèn)的質(zhì)量較好的右旋糖酐鐵注射液。國內(nèi)廠家無法生產(chǎn)出這樣的特微分子右旋糖酐鐵的原因主要是由于國內(nèi)的右旋糖酐生產(chǎn)廠家雖然用酶法生產(chǎn)出高分子右旋糖酐（分子量約為5×108Da），但用酸解法對高分子右旋糖酐進(jìn)行降解，再用乙醇分級沉淀來獲得不同分子量的右旋糖酐，其生產(chǎn)成本高，而且極難得到特微分子右旋糖酐，因而無法給下游生產(chǎn)廠家（即右旋糖酐鐵的生產(chǎn)廠家）提供特微分子右旋糖酐。

為解決特微分子右旋糖酐（重均分子量為3000～6000 Da）的制備問題，曾和[1]提出了在右旋糖酐5（重均分子量為4500～5500 Da）的生產(chǎn)工藝中，用膜分離分級取代了用酒精分級分離，在生產(chǎn)工藝中雖然不用酒精，但其右旋糖酐分子量降解仍用酸加熱的方法進(jìn)行處理。該法的缺點(diǎn)是酸處理后需用堿中和，這一過程必將產(chǎn)生廢液——氯化鈉液，增加“三廢”的處理，而且，酸堿的用量較大，增加生產(chǎn)成本，同時(shí)酸解法需在較高的溫度下進(jìn)行，降解時(shí)間長，能耗高，該法得到的右旋糖酐產(chǎn)品的分子量分布也較寬，要獲得分子量分布較窄的右旋糖酐，則右旋糖酐的損耗較大，產(chǎn)量相對較低。劉榮動(dòng)等人[2]提出了用堿解法來降解分子量較大的右旋糖酐，該方法的缺點(diǎn)與曾和提出的酸解法基本一樣。姚日生等人[3]提出了在用腸膜狀明串珠菌所產(chǎn)的右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐過程中，加入右旋糖酐酶降解生成的高分子右旋糖酐，但該法的降解時(shí)間較長，為24h，且得到的右旋糖酐產(chǎn)品的重均分子量較大，達(dá)1.0×105～2.0×104Da。

因此，要解決右旋糖酐鐵生產(chǎn)廠家用于生產(chǎn)特微分子右旋糖酐鐵的特微分子右旋糖酐原料難求的問題，迫切需要探索出一條可直接降解較大分子量的右旋糖酐為特微分子右旋糖酐后無需處理直接用于制備特微分子右旋糖酐鐵的生產(chǎn)工藝。

右旋糖酐酶是降解右旋糖酐的專一的酶，本試驗(yàn)的依據(jù)是基于酶的專一性的原理，即右旋糖酐是右旋糖酐酶的專一底物，右旋糖酐酶專一打斷右旋糖酐的α-1,6糖苷鍵而實(shí)現(xiàn)的。該法的反應(yīng)條件既溫和安全，又易于控制產(chǎn)物的分子量，可直接將較大分子量的右旋糖酐降解到分子量分布較窄、重均分子量為3000～6000 Da的特微分子右旋糖酐，而且該法還是一種清潔的生產(chǎn)工藝，不需加酸或堿，無需處理氯化鈉，工藝簡單，右旋糖酐損耗極少，生產(chǎn)成本低，降解后無需處理可直接用于氧化、絡(luò)合生產(chǎn)高質(zhì)量的特微分子右旋糖酐鐵，可解決右旋糖酐鐵生產(chǎn)廠家的特微分子右旋糖酐原料難求的問題。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料與分析儀器

右旋糖酐20(重均分子量為17363Da，分布寬度指數(shù)為1.65），右旋糖酐酶（酶活為690U·mL-1）。

DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器，RID-10A色譜工作站，TSK-GEL凝膠色譜柱。

1.2 試驗(yàn)方法

在500mL燒杯中加入適量的水和20g右旋糖酐20，攪拌升溫到右旋糖酐完全溶解后降溫到45～55℃，然后加入一定量的右旋糖酐酶，恒溫反應(yīng)一定的時(shí)間后升溫到80～90℃將右旋糖酐酶滅活即可得到特微分子右旋糖酐溶液。

1.3 右旋糖酐重均分子量檢測

利用凝膠滲透色譜法（gelpermeation chromatography,GPC)檢測右旋糖酐的重均分子量。用7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)相對分子量右旋糖酐做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，重均相對分子量為2500～41000。

色譜分析流動(dòng)相為硫酸鈉（0.71%）和疊氮化鈉（0.02%）的水溶液，樣品質(zhì)量濃度0.1g·(10mL)-1，流速0.5mL·min-1,檢測器溫度35℃。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 底物濃度對降解產(chǎn)物重均分子量的影響

表1為底物濃度對降解產(chǎn)物重均分子量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表1可見，在反應(yīng)時(shí)間和酶用量不變的情況下，底物濃度越低，產(chǎn)物的重均分子量越小。

表1 底物濃度對產(chǎn)物重均分子量的影響結(jié)果

2.2 反應(yīng)時(shí)間對降解產(chǎn)物重均分子量的影響

表2是反應(yīng)時(shí)間對降解產(chǎn)物重均分子量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表2可以看出，反應(yīng)時(shí)間越長，產(chǎn)物的重均分子量越小。

2.3 酶用量對降解產(chǎn)物重均分子量的影響

表3是酶用量對降解產(chǎn)物重均分子量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表3可見，酶用量越大，產(chǎn)物的重均分子量越小。

表2 反應(yīng)時(shí)間對產(chǎn)物重均分子量的影響結(jié)果

表3 酶用量對產(chǎn)物重均分子量的影響結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以右旋糖酐20（重均分子量為17363，分布寬度指數(shù)為1.65）為原料，根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果確定的生產(chǎn)工藝條件［底物濃度為30%（W/W），反應(yīng)時(shí)間為10min，酶用量為69U·g-1］進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表4的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，以右旋糖酐20為原料，按確定的生產(chǎn)工藝條件生產(chǎn)，得到的特微分子右旋糖酐產(chǎn)物的質(zhì)量穩(wěn)定，分布寬度指數(shù)小，分子量分布范圍窄。

原料右旋糖酐及產(chǎn)物右旋糖酐的重均分子量檢測結(jié)果見圖1、2。

圖1 原料右旋糖酐重均分子量檢測結(jié)果

圖2 產(chǎn)物特微分子右旋糖酐重均分子量檢測結(jié)果

3 結(jié)論

用右旋糖酐酶可將分子量較大的右旋糖酐20（重均分子量為16000～24000Da）降解為分子量較小的特微分子右旋糖酐（重均分子量則為 3000～6000 Da）。降解后所得產(chǎn)物的重均分子量的大小主要受底物濃度、反應(yīng)時(shí)間和酶用量等因素的影響。試驗(yàn)結(jié)果確定的最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件為：底物濃度為30%（W/W），反應(yīng)時(shí)間為10min，酶用量為69U·g-1。以右旋糖酐20為原料，按確定的生產(chǎn)工藝條件生產(chǎn)，得到的特微分子右旋糖酐產(chǎn)物的質(zhì)量穩(wěn)定，分布寬度指數(shù)小，分子量分布范圍窄。

[1] 曾和.一種右旋糖酐5及其生產(chǎn)工藝[P].CN 101205256A，2008-06-25.

[2] 劉榮動(dòng)，馬振廣，張國強(qiáng)，歐啟川.葡聚糖鐵的制備方法[P].CN 1041762A，1990-05-02.

[3] 姚日生，董明輝，朱慧霞.酶法合成右旋糖酐相對分子質(zhì)量的控制[J].精細(xì)化工，2007，24（10）：964-967.