血漿基質(zhì)金屬蛋白酶－2，9與CABG患者心功能NYHA分級(jí)的相關(guān)性研究

陜西省人民醫(yī)院急診內(nèi)科（西安710068） 陳新軍 劉潔琳 溫紹君

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類鋅離子依賴性蛋白水解酶，可降解心肌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），為心力衰竭的發(fā)展提供必要條件。基質(zhì)金屬蛋白酶－2（MMP－2），基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）又稱膠原酶，作用底物為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分Ⅳ型膠原纖維組織，因此在心力衰竭過程中起著重要作用［1］。我們利用明膠酶譜分析法測(cè)定了缺血性心臟病行冠脈搭橋術(shù)（CABG）患者，血漿 MMP－2，MMP－9的相對(duì)活性，并對(duì)膠原酶的活性表達(dá)水平和不同等級(jí)的心臟功能進(jìn)行分析，旨在探討其在心力衰竭的心臟分子標(biāo)記物中的臨床意義。

資料與方法

1 一般資料 隨機(jī)選取缺血性心臟病患者247例為觀察組，男129例，女118例，平均年齡55．1±6．9歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有糖尿病，缺血性腦病和嚴(yán)重炎癥，結(jié)核病以及腫瘤的患者。心功能分級(jí)（NYHA）：Ⅰ級(jí)49例，Ⅱ級(jí)86例，Ⅲ級(jí)75例，Ⅳ級(jí)37例。同期選取健康體檢的心臟功能正常的健康人群214例作為對(duì)照組，男108例，女106例，平均年齡54．9±6．3歲。兩組一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 方 法 觀察組患者術(shù)前抽取靜脈血4 ml，對(duì)照組查體時(shí)抽取靜脈血4 ml。置入肝素化的試管，在4℃，3000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，分離上清血漿，分裝于Eff endorf管中并保存在－80℃冰箱中。電泳前取血漿樣品4μl與Tris緩沖液16μl和等體積的上樣緩沖液混勻。血漿樣品蛋白定量采用Bradf or d法［2］。使用明膠酶譜試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司），以酶譜法［3］測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶的含量。制備含1 mg/ml明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）。取5μl上樣進(jìn)行SDS－PAGE電泳，加樣后于120 V直流電下電泳，到分離膠后，恒定電壓160 V電泳直到溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠底部。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS12．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以表示，兩組比較采用單因素方差分析，不同心功能分級(jí)的患者的MMPs酶活性與心臟功能等級(jí)的相關(guān)性分析采用Spear man相關(guān)分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組MMP2和MMP9活性表達(dá)的比較 觀察組透明帶的亮度較對(duì)照組高，條帶面積較對(duì)照組大。與對(duì)照組比較，觀察組MMP2，MMP9升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。觀察組嚴(yán)重心力衰竭患者（NYHAⅢ、Ⅳ級(jí)）和對(duì)照組血漿酶譜在92k D和72k D處有兩條透明帶，觀察組透明帶的亮度較對(duì)照組高，條帶面積較對(duì)照組大。

2 不同心功能分級(jí)患者M(jìn)MP2和MMP9活性表達(dá)的比較 觀察組中嚴(yán)重心力衰竭患者（NYHAⅢ、Ⅳ級(jí)）的血漿MMP－2，9的表達(dá)水平和對(duì)照 MMP－2，9表達(dá)水平存在顯著差異（P＜0．05），見附表。

附表 不同心臟功能分級(jí)之間MMPs活性表達(dá)水平

3 心功能分級(jí)患者M(jìn)MP2和MMP9活性表達(dá)的相關(guān)性分析 以Spear man相關(guān)對(duì)不同心功能分級(jí)患者M(jìn)MP2和MMP9活性表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果血漿MMP2和MMP9活性與NYHA心功能分級(jí)顯著相關(guān)（P＜0．05）。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)重度心衰者M(jìn)MP－2與MMP－9的活性表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0．05），表明 MMP－2和MMP－9與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)；這對(duì)于心力衰竭的預(yù)測(cè)與診斷有一定的意義，亦與Kelly等［4］的研究結(jié)論一致。目前認(rèn)為心肌細(xì)胞外基質(zhì)的變化是心力衰竭時(shí)心肌重構(gòu)的重要原因，主要是心肌膠原結(jié)構(gòu)和含量的變化，前者在心肌重構(gòu)的作用更為重要。在心衰的人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中均報(bào)道左室心肌膠原纖維網(wǎng)的結(jié)構(gòu)變化會(huì)影響到左心室?guī)缀涡螤睿?］。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌梗死后，左心室非梗死區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原的mRNA表達(dá)較對(duì)照組分別高2．6、2．1倍，而心肌梗死區(qū)則更為明顯；膠原成分的變化使原來對(duì)心肌穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用的Ⅰ型膠原被交叉連接差的膠原所替代，導(dǎo)致膠原限制心肌細(xì)胞的過度拉長(zhǎng)的作用喪失，引起心肌細(xì)胞拉長(zhǎng)、室壁變薄、心室擴(kuò)大，最終引起左室泵功能下降［4］。

冠狀動(dòng)脈狹窄或者阻塞引起的缺血性心臟病（除了急性心力衰竭外）在發(fā)展到心功能不全和衰竭前常經(jīng)歷復(fù)雜的心肌實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)ECM的改建。例如，心肌梗死后在非梗塞區(qū)由于進(jìn)行性的ECM增加，尤其是Ⅰ型膠原大量沉積和Ⅰ/Ⅲ型膠原比列升高，使非梗塞區(qū)心肌僵硬度增高而順應(yīng)性降低從而引起心臟舒張功能不全或衰竭［6］。但另一方面，細(xì)胞外基質(zhì)在梗塞區(qū)的變化則不同，在心功能失代償時(shí)，由于MMP1和MMP2激活而TI MP水平下調(diào)，使梗塞區(qū)ECM降解增加，室壁變薄和擴(kuò)張。這些變化可以減弱心臟收縮功能從而加速CHF的發(fā)生和發(fā)展［2］。

本研究中，我們觀察到隨著NY HA心功能分級(jí)的惡化，患者血漿 MMP－2、MMP－9活性顯著升高，并且明顯高于心臟功能正常者，提示 MMP－2、MMP－9與心功能NYHA分級(jí)密切相關(guān)；有可能作為推測(cè)心力衰竭進(jìn)展及預(yù)后的心臟分子標(biāo)志物。

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［4］Kelly D，Khan SQ，Tho mpson M，et al．Plas ma tissue inhibitor of metalloproteinase－1 and matrix metalloproteinase－9：novel indicators of left ventricular re modelling and prognosis after acute myocardial infarction［J］．Eur Heart J，2008，29：2116－2124．

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［6］Kelly D，Cockerill G，Ng LL，et al．Plas ma matrix metalloproteinase－9 and left ventricular remodelling after acute myocar dial infarction in man：a prospective cohort st udy［J］．Eur Heart J，2007，28：711－718．