激光輔助孵出對凍融胚胎著床潛能的影響

天津市中心婦產科醫院生殖醫學中心（天津300100） 杜湧瑞 張云山 姚汝強 羅海寧 魯振宇 王毅娜

輔助孵化（AH）是對移植前胚胎透明帶施行人工開口或削減其厚度，使胚胎更易孵出的方法。目前，激光輔助孵化以其簡便、準確、有效等特點逐漸被應用于人類輔助生殖技術［1］。胚胎在凍融程序中暴露于極低的溫度可能會加速透明帶的硬化，使胚胎發育為囊胚后不能孵出而影響著床，這可能是導致凍融胚胎臨床妊娠率低于新鮮胚胎的原因之一［2］。有報道認為，對凍融后胚胎進行輔助孵出有助于提高臨床妊娠率［3］。本研究旨在排除子宮內膜、胚胎質量等因素探討激光輔助孵出（LAH）對凍融胚胎著床潛能的影響。

資料與方法

1 一般資料 選取2009年3月至2010年12月期間曾在我院生殖醫學中心接受常規IVF或ICSI治療的不孕患者行冷凍胚胎－解凍移植病例。入選條件為：年齡在23～43歲，基礎血FSH值正常（3～12IU/L），在治療期間無盆腔感染病史，子宮內膜厚度≥8 mm，前次解凍移植胚胎質量好（移植2個或2個以上無損傷Ⅰ～Ⅱ級胚胎）而未妊娠者，與本中心簽署知情同意書。入選病例共116個周期，其中56例冷凍胚胎－解凍移植后行激光輔助孵出，作為LAH組；同期60例行常規冷凍胚胎－解凍移植作為對照組。

2 凍融胚胎移植 ①胚胎冷凍：分裂期胚胎進行評分［4］，Ⅰ級：細胞大小均勻，形狀規整，碎片0～5%；Ⅱ級：細胞大小略不均勻，形狀略不規整，碎片10%～20%；Ⅲ級：細胞大小不均勻，形狀不規整，碎片20%～50%；Ⅳ級：碎片＞50%。選擇移植后剩余的Ⅰ～Ⅱ級胚胎冷凍保存。將胚胎依次置于磷酸緩沖液（PBS）、含1．5 mol/L丙二醇（PROH）的PBS、含1．5 mol/L PROH＋0．1 mol/L 蔗糖的PBS中平衡，然后將1～3個胚胎裝入一個麥管，行程序化冷凍（Planer，kryo320－1．7，英國）。②子宮內膜的準備：有排卵的患者采用自然周期方案，月經第10天起B超監測卵泡發育和子宮內膜情況，若子宮內膜8～14 mm且為三線征，自然排卵后肌注黃體酮50～100 mg。激素替代方案用于無排卵的患者，月經第3天每日口服補佳樂2 mg（法國先靈制藥，每片含戊酸雌二醇1 mg），每隔3d增加2 mg，至6 mg/d，此劑量維持至月經14d子宮內膜達到要求時肌注黃體酮，肌注黃體酮第三天定為移植日。③胚胎解凍：從液氮罐中取出凍存麥管，室溫平衡30s，30℃水浴30s，剪斷凍存麥管棉塞處，然后將胚胎依次轉入含 1．0 mol/L PROH＋0．2 mol/L 蔗糖的PBS液、0．5 mol/L PROH＋0．2 mol/L 蔗糖的 PBS液、含0．2 mol/L蔗糖的PBS液和無PROH和蔗糖的PBS液中平衡，最后移入囊胚期G2培養液中，培養2h后進行移植。解凍后的胚胎評分標準同冷凍前，部分死亡的卵裂球記為碎片，50%上卵裂球存活的胚胎記為存活胚胎。④輔助孵出：移植前1h，LAH組采用1．48μm非接觸式激光（MTG激光儀，德國）薄化透明帶［5］。即將解凍后胚胎置于20倍倒置鏡下，選擇卵周隙相對較大或碎片集中區，調整激光靶心使其位于該區透明帶外緣，根據透明帶厚度通過改變照射時間來調整激光照射在透明帶上的孔徑，一般為20～25 ms，形成一個約相當于透明帶總長度的1/4、深度為透明帶總厚度的50%～80%的薄化區，將輔助孵出后的胚胎放入培養箱繼續培養至移植。⑤胚胎移植與妊娠結局判斷：選擇1～3枚卵裂球存活不少于一半卵裂球的胚胎行B超下移植，移植后14d測尿h CG，陽性者移植后4周超聲檢查示子宮腔內見妊娠囊及原始心管搏動即確定為臨床妊娠。

3 統計學處理 采用SPSS 10．0軟件對數據進行處理，行方差分析和χ2檢驗。

結 果

臨床結果見附表。患者在平均年齡、平均移植胚胎數上，兩組無顯著差異。在臨床妊娠率上，LAH組為53．3% （30/56），對照組為36．7% （22/60），LAH組較對照組高，兩組之間差異具有顯著性 （P＜0．05）；在胚胎種植率上，LA H 組為29．3%，對照組為17．9%，兩組之間差異具有顯著性（P＜0．05）。

附表 LAH組與對照組臨床數據比較

討 論

胚胎冷凍技術可提高輔助生殖技術（ART）的周期效率，但臨床妊娠率、種植率比新鮮周期低。目前的研究認為，透明帶在暴露于極低的溫度后變硬導致孵出困難是臨床妊娠率、種植率下降的主要原因。輔助孵出是對移植前胚胎施行人工開口或削減其厚度，使胚胎更易孵出的方法，主要方法有機械切割法、激光法、酸化法等［6－7］。目前，不同輔助孵出方法的效果仍存在爭議，Balaban等［8］對透明帶切割法（PZD）、酸化法、酶化法和激光法研究比較，結果發現4種方法的妊娠率和胚胎種植率相似。羅亞寧等［9］的研究中認為，對前次IVF失敗者和透明帶較厚患者的透明帶進行局部激光薄化，可取得很好的助孕結果。同樣，張愛軍等［10］的研究也表明激光法可以顯著提高囊胚的孵出率。Kung等［11］則采用激光法對d3胚胎的透明帶進行薄化后培養至囊胚，部分移植部分冷凍，也同樣獲得了理想的妊娠率和種植率。盡管LA H被認為是一種安全的途徑，但因激光在AH過程中會產生熱量，可能影響到胚胎發育潛能，同時對胚胎透明帶的顯微操作會增加發生單卵雙胎的危險性［12］。美國生殖醫學會（ASRM）［13］認為目前沒有證據表明輔助孵出可作為常規技術應用于輔助生殖領域中，其安全性及有效性有待于進一步實驗證實。ASRM建議輔助孵出應用于臨床上預后差的患者，包括兩次或以上IVF周期失敗者，胚胎質量差者，高齡患者（＞38歲）。在我們的研究中，為了盡可能排除干擾因素，所選擇兩組患者均為前次FET周期移植胚胎質量好而未妊娠者，且平均年齡、不孕原因、FSH基礎值、子宮內膜厚度、每周期移植胚胎數、復蘇后無損傷胚胎存活率、移植胚胎形態學評分、透明帶厚度等比較均無顯著性差異。LAH組臨床妊娠率，胚胎種植率明顯高于對照組（P＜0．05），而早期流產率并未顯著性差異，提示LA H處理后有利于胚胎的孵出，可提高胚胎的著床效率。對于FET周期反復失敗患者行LAH可改善患者的預后。然而，在臨床應用中，操作者的經驗至關重要，激光薄化透明帶的位置、厚度、作用時間，對于胚胎發育和著床是至關重要的。盡管LAH對提高反復FET周期失敗患者的預后有所幫助，但激光的物理熱效應對胚胎發育的遠期影響有待觀察，因此該項技術還不宜應用于所有FET周期。

［1］Ger mond M，Nocera D，Senn A，et al．Improved fertilization and i mplantation rates after non－touch zona pellucida micr odrilling of mouse oocytes with a 1．48 micro m diode laser beam［J］．Hu m Reprod，1996，11（5）：1043－1048．

［2］Vanderzw P，Bertin G，Debauche CH，et al．Vitrification of hu man blastocysts with t he He mi－Straw carrier；application of assisted hatching after thawing［J］．Hu man Reproduction，2003，18（7）：1504－1511．

［3］Balaban B，Ur man B，Yakin K，et al．Laser－assisted hatching increases pregnancy and i mplantation rates in cr yopreser ved embr yos that were allowed to cleave in vitr o after thawing：a prospective rando m zed study［J］．Hu man Repr oduction，2006，21（8）：2136－2140．

［4］鄧曉惠．生殖醫學技術及其彩色圖譜［M］．濟南：山東科學技術出版社，2004：20－21．

［5］Gab rielsen A，Ager hol m I，Toft B，et al．Assisted hatching i mproves i mplantation rates on cryopreserved－thawed e mbryos：a rando mized prospective study［J］．Hu m Repr od，2004，19（10）：2258－2262．

［6］Ng EHY，Chan CCW，Tang OS，et al．Comparison of endo metrial and sub endo metrial blood flow measured by three di mensional powers Doppler ultrasound bet ween sti mulated and natural cycles in the sa me patients［J］．Hu m Reprod，2004，19（10）：2385－2390．

［7］Gabrielsen A，Ager hol m I，Toft B，et al．Assisted hatching i mproves i mplantation rates on cryopreserved－thawed embryos．A randomized prospective study［J］．Hu m Repr od，2004，19（10）：2 258－262．

［8］Balaban B，Ur man B，Alatas C，et al．A comparison of four different techniques of assisted hatching ［J］．Hu m Reprod，2002，17（5）：1239－1243．

［9］羅亞寧，肖西峰，王曉紅，等．激光薄化部分透明帶輔助孵化的臨床應用［J］．陜西醫學雜志，2008，37（6）：663－665．

［10］張愛軍，馮 云，夏 蘭，等．不同機械輔助孵化方式對小鼠胚胎體外發育影響的研究［J］．生殖與避孕，2005，25（11）：675－678．

［11］Kung FT，Lin1 YC，Tseng YJ，et al．Transfer of frozent hawed blastocysts t hat under went quarter laser－assisted hatching at the day3 cleaving stage before freezing ［J］．Fertil Steril，2003，79（4）：893－899．

［12］Schieve LA，Meikle SF，Peterson HB，et al．Does assisted hatching pose a risk for monozygotic t winning in pregnancy conceived through in vitro fertilization［J］．Fertil Steril，2000，74：288－294．

［13］American Society for Reproductive Medicine．The role of assisted hatching in vitro fertilization：A review of literature：A co mmittee opinion ［J］．Fertil Steril，2008，90：196－198．