哮喘患者外周血轉錄因子Foxp3 mRNA表達水平及臨床意義

西安市第一醫院（西安710002） 譚 楠

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞因子參與的氣道慢性炎癥性疾病，其發病機制尚不完全清楚，T淋巴細胞在哮喘發生、發展過程中發揮重要作用。CD4＋CD25＋Treg細胞是新近發現的具有特異細胞膜表面分子和核轉錄因子的一類T細胞亞群，叉頭翼狀螺旋轉錄因子3（Foxp3）是Treg細胞的發育和功能維持中發揮重要作用的轉錄因子［1］。國內外研究證實哮喘患者體內，CD4＋CD25＋Treg細胞數量較正常人減少［2－4］，但有關Foxp3在哮喘中作用研究較少。本研究通過檢測不同分期及不同疾病嚴重程度哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA表達水平，初步探討Foxp3在哮喘發病中的作用。

對象與方法

1 研究對象 選擇2010年1～6月在我院住院的哮喘患者63例，男30例，女33例，平均年齡34．65±8．36歲。所有患者均符合2003年中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組制訂的支氣管哮喘防治指南中的診斷標準，并根據標準分為急性發作期36例（其中輕中度23例，重度13例），非急性發作期27例。正常對照組40例，男19例，女21例，平均年齡32．79±8．15歲，為我院健康體檢者，均無過敏病史及家族史，近期無感染及其它疾病。

2 方 法 采集研究對象肘靜脈肝素抗凝血5 ml，利用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，加入1 ml Trizol試劑裂解細胞，提取細胞總RNA，應用Fer mentas逆轉錄試劑盒合成的c DNA。根據文獻［5］合成Foxp3及內參照GAPDH引物，具體引物序列如下：Foxp3 上 游 引 物 5＇－CTACGCCACGCTCATCCGCTGG－3＇，下游引物5＇－GTAGGGTTGGAACACCTGCTGGG－3＇，內參照 GAPDH 上游引物5＇－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3＇，下 游 引 物 5＇－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3＇。20μl PCR 反應體系如下：10μl SYBRRPre mix Ex TaqTMⅡ（2×）、2μmol/L上、下游引物各2μl、6．0μl c DNA。采用兩步法進行PCR擴增，其程序如下：95℃預變性30s，95℃5s、60℃30s 40個循環。擴增結束后利用Bio－Rad IQ520 Standar d Edition Optical Syste m Soft ware V2．0進行數據分析。

3 統計學處理 利用SPSS 16．0軟件進行統計學處理，計量資料用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 哮喘組和對照組Foxp3 mRNA表達水平的比較 見表1。哮喘組患者外周血Foxp3 mRNA表達水平明顯降低，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0．05）。

表1 哮喘組和對照組Foxp3 mRNA表達水平的比較

2 不同臨床分期哮喘組Foxp3 mRNA表達水平的比較 見表2。急性發作期患者外周血Foxp3 mRNA表達水平明顯降低，與非急性發作期患者相比差異有統計學意義（P＜0．05）。

表2 不同臨床分期哮喘組Foxp3 mRNA表達水平的比較

3 急性發作期不同嚴重程度哮喘患者Foxp3 mRNA表達水平的比較 見表3。急性發作期重度哮喘患者外周血Foxp3 mRNA表達水平明顯降低，與輕中度患者相比差異有統計學意義（P＜0．05）。

表3 急性發作期不同嚴重程度哮喘患者Foxp3 mRNA表達水平的比較

討 論

哮喘的發病機制不完全清楚，可能與免疫反應、神經反應及氣道高反應性有關，研究證實免疫功能紊亂參與了哮喘的發病過程，輔助性T細胞（主要是Th2細胞）數量增加或功能異常與哮喘發病密切相關。1995年Sakaguchi等人首先報道了小鼠體內天然存在CD4＋CD25＋Treg細胞，隨后在人外周血中也發現了該群細胞。越來越多實驗證實CD4＋CD25＋Treg細胞在自身免疫、腫瘤免疫、移植免疫耐受及抗感染免疫等方面發揮重要的作用［6－8］。

我們前期研究結果［2］顯示在哮喘患者體內CD4＋CD25＋Treg細胞數量較正常人減少，在哮喘的疾病活動中起著重要作用，是導致哮喘患者細胞免疫失調的重要原因，這與國內外研究結果一致［2－4］。Foxp3在CD4＋CD25＋Treg細胞的發育和功能維持中發揮重要作用，是該群細胞的一個特征性標志［1］，為了研究Foxp3在哮喘發病中的作用，我們利用熒光定量PCR檢測不同分期及不同疾病嚴重程度哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA表達水平，結果發現哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA明顯低于正常對照組，這與CD4＋CD25＋Treg細胞數量減少一致。Foxp3在CD4＋CD25＋Treg細胞的發育及功能成熟過程中發揮重要作用，Foxp3在哮喘患者體內表達降低，可能使CD4＋CD25＋Treg細胞數量減少，抑制其功能的發揮，從而打破了CD4＋CD25＋Treg細胞與Th2細胞之間的平衡，使Th2細胞增殖和活化增強，導致哮喘的發生。目前Foxp3對Treg細胞功能基因表達的調控機制尚未完全清楚，Foxp3可能抑制Treg細胞活化過程中的多個關鍵基因及激活其他許多基因的表達來參與Treg細胞的發育及功能成熟過程。同時我們的實驗還發現在急性發作期及重度患者體內Foxp3 mRNA表達水平均明顯降低，提示Foxp3與哮喘的分期及病情嚴重程度密切相關，Foxp3不僅與哮喘的發生有關，而且在其病程進展過程中發揮重要作用。

總之，本實驗發現哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA表達水平明顯降低且與疾病分期及病情嚴重程度密切相關，Foxp3表達水平降低可能在哮喘的發病過程中發揮作用，但具體的機制需要進一步研究證實。隨著對CD4＋CD25＋Treg細胞及Foxp3的研究不斷深入，有可能通過上調Foxp3的水平使CD4＋CD25＋Treg數量增加或功能增強，重建CD4＋CD25＋Treg細胞與Th2細胞之間的平衡，為哮喘治療提供新的思路。

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