活血化瘀通絡方對5/6腎切除大鼠腎功能及腎組織p38MAPK信號轉導途徑的干預作用※

張長明 顧耀東 符 丹 陽貴林 何立群 邵命海

(上海中醫藥大學附屬市中醫醫院腎內科，上海 200071)

活血化瘀通絡方對5/6腎切除大鼠腎功能及腎組織p38MAPK信號轉導途徑的干預作用※

張長明 顧耀東 符 丹 陽貴林 何立群△邵命海1

(上海中醫藥大學附屬市中醫醫院腎內科，上海 200071)

目的從p38MAPK信號轉導途徑觀察5/6腎切除大鼠腎組織中P38 MAPK表達及α－平滑肌肌動蛋白(α－SMA)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)改變，以初步探討活血化瘀通絡方(抗纖靈方)延緩腎纖維化的作用機制。方法將40只SD大鼠中10只為正常組，30只行5/6腎切除，造模成功后隨機分為模型組、抗纖靈組、氯沙坦組，各10只，各組干預12周后檢測各組腎功能(血清尿素氮、肌酐)以及Western Blot檢測腎組織CollagenⅠ、p38MAPK、α－SMA。結果干預12周后抗纖靈組、氯沙坦組較模型組肌酐、尿素氮有所下降，抗纖靈組、氯沙坦組p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ的分子表達較模型組明顯減輕(P＜0.05)，抗纖靈組較氯沙坦組p38MAPK、CollagenⅠ分子表達減少(P＜0.05)。結論抗纖靈方可明顯改善5/6腎切除大鼠的腎功能，可能通過抑制p38MAPK信號轉導通路，減少α－SMA、CollagenⅠ的表達，減輕腎組織的損害。

p38絲裂原活化蛋白激酶類;生物合成;疾病模型，動物;腎疾病;中藥療法

腎間質纖維化是多種腎臟疾病發展至腎衰竭的共同病理過程，其發病機制迄今為止仍未得到完全闡明。通常認為是多因素綜合作用的結果，涉及細胞外基質合成增多及降解減少、促纖維化細胞因子表達上調、單核巨噬細胞等炎癥細胞的浸潤，氧自由基生成過多、清除減少及腎間質細胞凋亡等方面，細胞信號轉導參與多種病理過程［1］。中藥抗纖靈組方在治療慢性腎衰竭方面療效顯著，既往研究可以抑制腎間質纖維化，抗氧自由基，改善腎血流動力學等［2］。本研究通過對5/6腎切除大鼠腎組織中的p38MAPK分子表達及抗纖靈沖劑的干預，以期闡明活血化瘀通絡中藥治療慢性腎衰竭的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SPF級雄性SD大鼠40只，8周齡，體質量(180±20)g，由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號:SYXK(滬)2004－0005，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，12 h光照，45%左右相對濕度的飼養籠中，自由飲食。

1.2 藥物與試劑 抗纖靈藥物組成:丹參15 g，制大黃15 g，桃仁12 g，當歸12 g，牛膝9 g。大鼠按照成人20倍服用劑量，制作水提濃縮液，含生藥2 g/mL，每次灌胃2 mL。氯沙坦(50 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字H20100972)。

1.3 動物模型制作、分組及給藥 大鼠購買后飼養1周，隨機取10只為正常組，不做處理，直接分籠飼養。其余為造模組，3%戊巴比妥鈉按1.8 mL/kg劑量腹腔注射麻醉。大鼠俯臥暴露左腎區。備皮后，從距左脊肋骨1.5 cm處做斜向外方切口，經后腹膜取腎，暴露腎臟，剝離腎周脂肪及包膜后，弧型切除2/3腎組織(主要切除皮質部分)約0.4 g。明膠海綿壓迫止血，切面無活動性出血后，復位剩余左腎并縫合。7 d后相同方法麻醉大鼠，完全游離右側腎蒂后結扎，行右腎完全結扎術。2次手術相當于切除腎臟約80%。將造模組大鼠按上述方法制作慢性腎衰竭動物模型。10 d后動物模型制備成功后，再隨機將造模組分為模型組10只、抗纖靈組10只、氯沙坦組10只。正常組、模型組均予以0.9%氯化鈉注射液2 mL/d灌胃。抗纖靈組予抗纖靈煎液2 mL/d灌胃，氯沙坦組予氯沙坦水溶液2 mL/d，每mL含抗纖靈或氯沙坦的劑量相當于30 kg體質量成人每日臨床用量的10倍。

1.4 觀察指標及方法 藥物干預12周后全部處死，心臟取血液5 mL，分離血清后常規檢測腎功能(尿素氮、肌酐)，腎臟組織:取腎皮質分為2份，一份用10%中性福爾馬林固定，經脫水、包埋，切成2 μm厚石蠟片做蘇木伊紅(HE)染色，觀察腎組織病理改變。一份腎組織于液氮中速凍后－80℃冰箱保存。

Western Blot檢測方法。蛋白樣品制備:先進行蛋白抽提，BCA法測蛋白濃度，在562 nm左右測光吸收度，做標準曲線，計算蛋白樣品濃度，調整蛋白樣品濃度至1 g/L。取30 g蛋白樣品與1/4體積樣品緩沖液混勻，95℃，5 min。配膠，上樣(1.5 mm，10 well，37.5L)，電泳，80 V恒壓30 min后，換120 V恒壓。當溴酚藍前沿遷移至凝膠底部時，停止電泳。轉膜:配制轉膜緩沖液，4℃預冷。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中浸潤5～10 min，用水漂洗，再放入轉膜液中。轉膜時電壓為10 V，50 min。轉膜后，將膜放置于封閉液中，TBS緩沖液(Tris緩沖鹽溶液)+0.05%Tween－20即TBST;封閉液:5%牛血清白蛋白溶于TBST中，室溫下搖床振蕩1h。封閉后，用TBST洗膜3次，5 min/次。用抗體稀釋液稀釋一抗，檢測所需的一抗:CollagenⅠ、α－平滑肌肌動蛋白(α－SMA)購自Abcam(香港)有限公司;p38MAPK購自Cell Signaling Technology公司。批號:CollagenⅠab90395;α－SMA ab7817，p38MAPK，#9212。將膜浸泡于一抗反應液中，4℃過夜。過夜后，將膜置于室溫復溫30 min～1 h。洗膜:室溫下，用TBST漂洗膜，4次，5 min/次。孵育二抗:用TBST稀釋二抗，Goat Anti－ Mouse和 Goat Anti－ Rabbit，1∶5000。室溫避光孵育15 min，然后用TBST沖洗5 min，在近紅外雙色激光成像儀器中進行掃描，最后將得到的圖片進行灰度值分析，甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參。計算各組灰度值與GAPDH的比值進行分析。

1.5 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，計量資料用均數±標準差(xˉ±s)表示，采用完全隨機設計的單因素方差分析(ANOVA)，多組之間的兩兩比較采用LSD－t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組12周時血清尿素氮、肌酐檢測結果 見表1。

表1 各組12周時血清尿素氮、肌酐檢測結果±s

表1 各組12周時血清尿素氮、肌酐檢測結果±s

與模型組比較，*P ＜0.05;與抗纖靈組比較，△P ＜0.05

組 別 n 尿素氮(nmol/L) 肌酐(μmol/L)正常組10 5.630 ±0.365 30.400 ±2.757模型組 10 8.620 ±0.658 60.900 ±10.060抗纖靈組 10 7.167 ±0.686* 44.333 ±21.325*氯沙坦組 10 7.970±0.914＊△ 48.900±5.343＊△

由表1可見，12周時抗纖靈組、氯沙坦組血清尿素氮、肌酐低于模型組(P＜0.05)，而抗纖靈組降低血清尿素氮、肌酐優于氯沙坦組(P＜0.05)。

2.2 各組12周時腎皮質p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ蛋白相對表達含量比較 見表2。

表2 各組12周時腎皮質p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ蛋白相對表達含量比較±s

表2 各組12周時腎皮質p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ蛋白相對表達含量比較±s

與模型組比較，*P ＜0.05;與抗纖靈組比較，△P ＜0.05

組 別 p38MAPK/GAPDH α－SMA/GAPDH CollagenⅠ/GAPDH正常組0.720 ±0.093 0.647 ±0.030 0.771 ±0.071模型組 1.387 ±0.061 0.951 ±0.040 1.683 ±0.171抗纖靈組 0.902 ±0.141* 0.779 ±0.063* 0.840 ±0.181*氯沙坦組 1.050 ±0.100＊△ 0.687 ±0.067* 0.996 ±0.006＊△

由表2可見，3種蛋白相對表達檢測抗纖靈組、氯沙坦組與模型組相比均有所降低(P＜0.05)，p38MAPK、CollagenⅠ氯沙坦組高于抗纖靈組(P＜0.05)。α－SMA氯沙坦組與抗纖靈組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，但均明顯低于模型組(P＜0.05)。

3 討論

引起慢性腎衰竭的原因有很多，本實驗選擇5/6腎切除模型進行研究，由于有效腎單位被大部分切除，殘余腎臟通過代償，引起腎系膜細胞、毛細血管等大量增生，腎通透性增加。健存腎單位代償性高濾過，導致腎小球的進一步硬化，進而引起腎小管間質損傷。殘余腎單位發生血流動力學改變，腎臟出現高灌注、高濾過、高跨膜壓(即所謂“三高學說”)，導致殘余腎代償性肥大、增生、硬化，最終表現為進行性腎小球、腎小管功能減退，后期進展為終末期腎病。

腎間質纖維化是以細胞外基質 (extracellular matrix，ECM)的不斷積聚和α－SMA陽性的肌纖維母細胞的不斷新生、活化為特征的過程。細胞外基質中主要成分就是Ⅰ型、Ⅲ型膠原等，腎間質纖維化是多種腎臟疾病發展至腎衰竭的共同病理過程［3］。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是聯系細胞膜受體與細胞內重要的酶類，在細胞信號轉導方面起重要作用，它能將細胞外刺激信號轉到細胞及其核內，引起細胞一系列生物學反應(如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等)［4］。p38MAPK信號通路作為MAPK家族的主要成員，通過對細胞內信號的傳遞參與細胞對外界許多刺激的調節反應。通過非磷酸化轉化為磷酸化狀態來促進下游底物的磷酸化，快速實現信號傳遞。腎臟固有細胞轉化成肌纖維母細胞并在腎間質中聚集、細胞外基質合成增多及降解減少、腎間質細胞凋亡等導致腎纖維化發生［5］。

中醫學認為，慢性腎衰竭的病機為本虛標實，本虛以脾腎虧虛為主，標實多為濕濁、熱毒、水氣、動風，而瘀血貫穿于慢性腎衰竭的始終。中醫的“瘀”范圍廣泛，病理方面表現為腎小球硬化、球囊粘連，小管間質纖維化和萎縮，腎小球內微血栓，系膜外基質增多，基底膜增厚，毛細血管腔塌陷或狹窄，血管襻擠壓、閉塞等改變。

抗纖靈多年來一直用于臨床和科研，方中當歸、丹參、桃仁養血活血通絡，制大黃活血降濁通便，牛膝補腎強腰膝，合方以活血化瘀通絡為主。既往結果表明本方可能通過降低大鼠腎組織NF－κB及ATⅡ、ATⅡ受體mRNA表達，延緩腎纖維化進展，進而保護殘余腎單位的功能［6］。

血管緊張素受體拮抗劑(ARB)，不僅可以降低腎性高血壓，還有一定的腎臟保護作用。其作用機制獨立于降壓之外，可以激活或抑制一些細胞因子或信號轉導途徑而起到腎臟保護有關［7］。氯沙坦(losartan)為非肽類高選擇性血管緊張素Ⅱ－1型受體(AT1)阻滯劑，可拮抗AngⅡ誘導足細胞表達血管內皮生長因子(VEGF)增高，提示ARB類藥物可以通過下調足細胞VEGF的表達水平，而減少蛋白尿的發生，發揮保護腎臟作用［8］。

本研究結果表明氯沙坦、抗纖靈均可以降低5/6腎切除大鼠血清尿素氮、肌酐，延緩腎臟功能惡化。改善腎功能抗纖靈組優于氯沙坦組，5/6腎切除術可能觸發p38MAPK信號轉導通路，誘導細胞內p38MAPK表達增加，進一步啟動促纖維化因子—α－SMA而誘導細胞內CollagenⅠ的合成，導致了腎纖維化的發生。抗纖靈方可能是通過抑制p38MAPK信號轉導通路，減少α－SMA、Ⅰ型膠原的表達，通過改善血流動力學等以減輕腎組織的損害。

［1］王海燕.腎臟病學［M］.北京:人民衛生出版社，2008:799－815.

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Intervention effect of prescription with promoting blood flow，dispersing blood stasis and dredge collateral on renal tissue p38MAPK signal transduction pathway in rats with 5/6 kidney resection

ZHANG Changming，GU Yaodong，FU Dan，et al.Department of Nephrology，Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200071

ObjectiveTo observe signaling molecules protein expression in the renal tissue and changes of a－SMA(a－smooth muscle actin)and Collagen I(type I collagen)by p38MAPK signal transduction pathway，and explore the mechanism of prescription with promoting blood flow，dispersing blood stasis and dredge collateral(Kangxianling prescription)for delaying renal fibrosis.Methods30 of 40 SD rats were made 5/6 kidney resection model，10 rats was as a normal group.30 rats with 5/6 kidney resection were randomly divided into model group，Kangxianling prescription group Losartan group.The levels of creatinine and urea nitrogen and molecules expression of p38MAPK，a－SMA and Collagen I were measured after intervention of 12 weeks.ResultsThe levels of creatinine and urea nitrogen in Kangxianling prescription group and Losartan group were decreased compared with those in the model group after 12 weeks.Molecules expression of p38MAPK，a－SMA and Collagen I in Kangxianling prescription group and Losartan group were decreased compared with those in the model group(P＜0.05).The expression of p38 MAPK and Collagen I in Kangxianling prescription group were decreased as compared with those in Losartan group(P＜0.05).ConclusionKangxianling prescription can significantly improve renal function of rat with 5/6 kidney resection，by inhibition of p38MAPK signal transduction pathways，to reduce the expression of a－SMA，I collagen，and mitigate the damage of kidney tissue.

p38 mitogen－activated protein kinase;Biosynthesis;Disease model;Animal;Renal disease;Traditional Chinese medicine therapy

R－332;R345.57;R692.053.1;R692.5

A

1002－2619(2012)11－1704－03

※項目來源:上海市衛生局科研課題(編號:2010220);國家自然基金(編號:81173219);科技部中醫藥行業科研專項(編號:201007005);高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(編號:20093107110006);上海市科委創新行動計劃項目(編號:11DZ1973100);上海市教育委員會E－研究院建設計劃資助項目(編號:E03008);上海高校創新團隊建設項目(編號:201203)

△通訊作者:上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎內科，上海201203

1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎內科，上海 201203

張長明(1970—)，男，副主任醫師，博士，碩士研究生導師。從事慢性腎衰竭的中西醫結合研究。

2012－07－16)