川椒方治療小鼠變應(yīng)性結(jié)膜炎的實(shí)驗(yàn)研究

李素毅 高健生 接傳紅 宋劍濤 嚴(yán) 京

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京市石景山區(qū)魯谷路33號(hào)，100040)

變應(yīng)性結(jié)膜炎(Allergic Conjunctivitis，AC)是最常見(jiàn)的眼表疾病之一，屬于中醫(yī)的“目癢”“癢如蟲(chóng)行癥”“時(shí)復(fù)證”范疇，病情復(fù)雜難治。川椒方為高健生主任醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)方，臨床上取得了良好的療效。本研究通過(guò)建立小鼠變應(yīng)性結(jié)膜炎的動(dòng)物模型，選擇癥狀學(xué)、細(xì)胞學(xué)和血清免疫學(xué)中的較為重要的指標(biāo)，驗(yàn)證川椒方對(duì)變應(yīng)性結(jié)膜炎的治療作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠，6～8周，體重18～20g。(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK京2009-0007)。

1.2 主要試劑 OVA(美國(guó) Sigma公司，A5503)，Al(OH)3(美國(guó)Sigma公司，A4682)，ELISA 試劑盒(美國(guó)R＆D公司，CK-E90529M)，川椒方水提液(中藥材購(gòu)自北京燕北藥材公司，知母、地膚子、牛蒡子、川芎、川椒、防風(fēng)等煎煮后取煎液蒸發(fā)濃縮)，鹽酸奧羅他定滴眼液(愛(ài)爾康公司)。

1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)(日本久保田3740)，病理包埋機(jī)(北京海鷹達(dá)科技發(fā)展公司BMG-011)，病理切片機(jī)(德國(guó)LEIC-RM2235)，正置式顯微鏡+圖像分析系統(tǒng)(日本OLYMPUS-BX51)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Rayto公司，RT-6000)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備及實(shí)驗(yàn)流程 參照Nakamura的AC小鼠模型方法［1］，balb/c小鼠進(jìn)入動(dòng)物房適應(yīng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。1)致敏階段:于實(shí)驗(yàn)第0天、7天、14天分別給予腹腔注射含OVA100μg與佐劑Al(OH)35mg共200μL的混合物使小鼠致敏。2)局部加強(qiáng)致敏:第15天至21天，每天每眼用OVA400μg溶于生理鹽水中點(diǎn)眼以加強(qiáng)致敏。3)激發(fā):第24天將OVA(每眼400μg)溶于pH7.2的PBS液中滴入雙眼進(jìn)行致敏原攻擊，以誘導(dǎo)AC癥狀。4)治療:第25天開(kāi)始至31天治療7天。5)再次激發(fā):7天治療結(jié)束后，再次OVA點(diǎn)眼局部激發(fā)，激發(fā)后20min觀察記錄AC超敏反應(yīng)情況，24h后摘眼球法采血，處死動(dòng)物，取結(jié)膜行HE、甲苯胺蘭染色，觀察切片變化并計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量;取血清，ELISA法檢測(cè)免疫球蛋白IgE、IgG1及免疫因子IL-4。

2.2 分組及處理 隨機(jī)分為6組，每組10只。1)空白組為非模型正常小鼠，生理鹽水灌胃;2)模型組為AC模型小鼠，生理鹽水灌胃;3)陽(yáng)性藥物對(duì)照組:AC模型小鼠，鹽酸奧羅他定滴眼液點(diǎn)眼;4)、5)、6)組用AC模型小鼠，分別以5倍、10倍、20倍川椒方水提液灌胃。

2.3 體征評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 于點(diǎn)眼激發(fā)20min后裂隙燈顯微鏡觀察眼部體征。采取盲法由臨床眼科醫(yī)師分別對(duì)結(jié)膜水腫、結(jié)膜充血、眼瞼浮腫、分泌物產(chǎn)生4項(xiàng)指標(biāo)的不同程度進(jìn)行評(píng)分(0～3分)。最后將4項(xiàng)指標(biāo)各自的分值相加得出總分，最低0分，最高12分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照 Magone［2］、呂秋軍［3］、徐巖等［4］標(biāo)準(zhǔn)，改良后具體見(jiàn)表1。

表1 改良后體征評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 再次激發(fā)24h后放血處死小鼠并立即取材。眼球及眼瞼一同取出后10%中性甲醛溶液固定，制蠟塊，4μm連續(xù)切片，蘇木素 -伊紅(HE)、甲苯胺蘭染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞、觀察肥大細(xì)胞。

2.5 免疫血清制備 用摘眼球法采血，4℃恒溫離心，3000r/min，15min，-20℃冰箱中低溫保存。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來(lái)表示。多組間的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析。2組間的比較，采用t檢驗(yàn);所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)。結(jié)果以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 裂隙燈下小鼠眼部體征評(píng)分(±s，n=10)

表2 裂隙燈下小鼠眼部體征評(píng)分(±s，n=10)

注:模型組與正常組相比，＊＊P＜0.01;川椒方各濃度組與模型組相比，△△P＜0.01;川椒方高濃度組與陽(yáng)性藥物組相比，※P＞0.05;川椒方中、低濃度組與陽(yáng)性藥物組相比，*P＜0.05。

1.60 ±0.84模型組 10.80 ±1.23＊＊陽(yáng)性藥物組 5.50 ±1.08川椒方低濃度組 7.10 ±1.52△△＊川椒方中濃度組 7.00 ±1.25△△＊川椒方高濃度組 6.00 ±1.05組別 眼部體征積分正常組△△※

3 結(jié)果

3.1 AC小鼠模型觀察 模型較正常小鼠易激惹或倦怠，易脫毛。裂隙燈下觀察見(jiàn)瞼裂較小，充血水腫明顯，部分嚴(yán)重小鼠內(nèi)眥部可見(jiàn)瘙癢后的抓痕。明顯畏光、流淚，黏液性分泌物增多，嚴(yán)重的浸濕全眼周皮毛。結(jié)膜充血呈烏紅色，血管迂曲，水腫明顯。病理切片顯示:結(jié)膜組織疏松，充血水腫明顯，固有層內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞及中粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肥大細(xì)胞明顯增多，脫顆粒現(xiàn)象明顯。

3.2 川椒方的治療作用

3.2.1 臨床癥狀評(píng)分 見(jiàn)表2。模型組較正常對(duì)照組評(píng)分增高，各川椒方組體征評(píng)分值較模型組明顯降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與陽(yáng)性藥物對(duì)照組相比，高濃度組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，低、中濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

3.2.2 病理切片觀察川椒方對(duì)晚期炎癥的影響 見(jiàn)表3。1)結(jié)膜內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:模型組小鼠結(jié)膜內(nèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常組增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各川椒方組結(jié)膜內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目較模型組明顯降低，其中，中濃度組和低濃度組與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，高濃度組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與陽(yáng)性藥物對(duì)照組相比，高濃度組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，低、中濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。2)肥大細(xì)胞:模型組小鼠結(jié)膜內(nèi)肥大細(xì)胞聚集增多脫顆粒明顯。治療后的各組以上特點(diǎn)都明顯減輕。其中高濃度組和陽(yáng)性藥物組表象基本一致。

表3 川椒方對(duì)小鼠結(jié)膜嗜酸性粒細(xì)胞的影響(±s，n=10)

表3 川椒方對(duì)小鼠結(jié)膜嗜酸性粒細(xì)胞的影響(±s，n=10)

注:模型組與正常組相比，＊＊P＜0.001;川椒方高濃度組與模型組相比，△P＜0.01;川椒方中、低濃度組與模型組相比，▲P＜0.05;川椒方高濃度組與陽(yáng)性藥物組相比，※P＞0.05;川椒方中、低濃度組與陽(yáng)性藥物組相比，*P ＜0.05。

0.40 ±0.70模型組 24.50 ±5.62＊＊陽(yáng)性藥物組 8.20 ±2.10川椒方低濃度組 13.90 ±2.60▲＊川椒方中濃度組 12.50 ±1.90▲＊川椒方高濃度組 8.60 ±1.51組別 嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)正常組△※

表4 ELISA檢測(cè)川椒方對(duì)AC小鼠血清指標(biāo)的影響(±s，n=10)

表4 ELISA檢測(cè)川椒方對(duì)AC小鼠血清指標(biāo)的影響(±s，n=10)

注:與正常組相比，★P ＜0.01;與模型組相比，▲P ＞0.05;與模型組相比，▲▲P ＜0.01;與模型組相比，●P ＜0.05;與陽(yáng)性藥物組比，※P ＞0.05;與陽(yáng)性藥物相比，△△P ＜0.01。

組別 IgE(μg/mL) IgG1(μg/mL) IL-4(pg/mL)正常組●※3.51 ±0.79 3.54 ±0.97 16.19 ±3.04模型組 7.53±0.84★ 9.13±0.62★ 26.32±5.53★陽(yáng)性藥物組 4.27 ±0.69 4.71 ±0.52 22.88 ±4.02川椒方低濃度組 6.98 ±0.88▲△△ 8.77 ±1.86▲△△ 20.76 ±4.75●※川椒方中濃度組 5.33±1.21▲▲△△ 6.24±1.01▲▲△△ 20.27±3.77●※川椒方高濃度組 5.13 ±0.73▲▲※ 5.59 ±0.68▲▲※ 20.11 ±1.98

3.3 川椒方的作用機(jī)理 ELISA檢測(cè)血清指標(biāo)顯示:1)模型組IgG1、IgE、IL-4升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。2)與模型組比較，中、高濃度組小鼠血清IgG1、IgE水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，低濃度組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);各濃度組IL-4均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3)與陽(yáng)性藥物對(duì)照組相比，高濃度組IgG1、IgE無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，療效相當(dāng)，中低濃度組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，療效差于西藥組(P＜0.01);各濃度組IL-4均降低，與陽(yáng)性藥物相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

變應(yīng)性結(jié)膜炎是一種高發(fā)的眼表疾病，人群患病率約20%［5］。隨著環(huán)境變化、污染加重，發(fā)病率仍有增長(zhǎng)的趨勢(shì)。局部用藥起效快，但作用不持久。長(zhǎng)期用藥尤其是使用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物會(huì)帶來(lái)干眼癥［6］、青光眼等嚴(yán)重并發(fā)癥。

川椒方是汲取《黃帝內(nèi)經(jīng)》、金代醫(yī)家劉完素學(xué)術(shù)思想“六氣發(fā)病皆從火化”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，發(fā)揮中醫(yī)學(xué)整體觀念的治療優(yōu)勢(shì)，靈活運(yùn)用中醫(yī)的辨證法，將溫?zé)崴幬锎ń放c寒涼藥物同用，去性取用，是用于治療AC的經(jīng)驗(yàn)方。作為內(nèi)服中藥湯劑，川椒方能有效改善AC急性期各項(xiàng)癥狀，并能減輕晚期細(xì)胞反應(yīng)帶來(lái)的損傷。不僅避免了局部用藥對(duì)眼表微環(huán)境的影響和嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥而且對(duì)患者常合并的變應(yīng)性鼻炎、哮喘等其他系統(tǒng)的變應(yīng)性疾病癥狀起到改善作用。

AC反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，涉及多種免疫機(jī)理及免疫因子參與。雖然機(jī)制尚不十分清楚，但I(xiàn)型變態(tài)反應(yīng)為主，IV型變態(tài)反應(yīng)參與作為基本機(jī)理是無(wú)異議的。起到了與西藥相當(dāng)?shù)寞熜В⑶矣衅洫?dú)特的優(yōu)勢(shì)，值得推廣和進(jìn)一步研究。

［1］Nakamura，Takao MD.Detailed Criteria for the Assessment of Clinical Symptoms in a New Murine Model of Severe Allergic Conjunctivitis.Cornea，Volume 22(7)Supplement 1，October 2003，pp S13-S18.

［2］M.Teresa Magone，Chi-Chao Chan.A Novel Murine Model of Allergic Conjunctivitis.Clinical Immunology And Immunopathology，1998，87:75–84.

［3］呂秋軍.新藥藥理學(xué)研究方法［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007，433-434.

［4］徐巖，陳祖基.變應(yīng)性結(jié)膜炎動(dòng)物模型［M］.眼科研究，2001，19(2):181.

［5］Berdy GJ，Hedqvist B.Ocular allergic disorders and dry eye disease:asslociations，diagnostic dilemmas，and management.Acta Ophthalmol Scand Supp，2000，230:32237.

［6］Xiong C，Chen D，Liu J，et al.A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(5):1850-1856.

［7］宋劍濤，楊薇，高健生，等.川椒方治療過(guò)敏性結(jié)膜炎的臨床觀察.中國(guó)中醫(yī)眼科雜志，2010，20(1):17-19.

(2011-09-08收稿)