EMMPRIN 基因表達對膠質瘤U251 細胞增殖、凋亡的影響

徐利民，陸永建，柳浩然

膠質瘤是中樞系統最常見的惡性腫瘤。目前手術治療無法根治，常規的放療及化療效果均較差，臨床預后差。基質金屬蛋白酶介導的組織內基底膜的降解在腫瘤的生長、血管形成、局部侵襲和遠處轉移中發揮重要作用，腫瘤細胞產生的細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子，誘導鄰近的成纖維細胞產生基質金屬蛋白酶，是促進腫瘤的侵襲和轉移的關鍵步驟。目前國內外尚未見以EMMPRIN 基因為靶點治療腦膠質瘤的相關報道。本研究旨在探討EMMPRIN 基因表達與腦膠質瘤細胞增殖、凋亡的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質瘤U251 細胞株為本實驗室傳代保存，轉染試劑LipofectameTM2000、Rabbit anti－EMMPRIN 購自美國Invitrogen 公司，RT－PCR 試劑盒購自日本Takara 公司，MTT 及PI 均購自美國Sigma 公司，siRNA－EMMPRIN 及陰性對照siRNA－negtive 購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 化學合成siRNA－EMMPRIN 及陰性對照siRNA－negtive 片段 由上海吉瑪制藥技術有限公司合成的兩對siRNA－EMMPRIN 序列以及陰性對照siRNA－negtive 片段序列如下:

siRNA－negative control 序列，Sense:5－UUCUCCGAACGUGUCUTT－3;Antisense:5－ACGUGACACGUUCGGAGGATT－3。siRNA－EMMPRIN－1序列，Sense:5－GUUGAUGUGUUCUGACGAC dTdT－ 3;Antisense:5－GUCGUCAGAACACAUCAACTT－ 3。siRNA－EMMPRIN－2 序列，Sense:5－GACGUUCUUGCCUUUGUCA dTdT－3;Antisense:5－UGACAAAGGCAACGUCTT－3。

1.2.2 逆轉錄酶－多聚酶鏈反應(RT－PCR)檢測EMMPRIN 基因mRNA 表達水平 本實驗分為3組:siRNA－negative control 序列轉染組為陰性對照組，siRNA－EMMPRIN－ 1 序列轉染組為實驗組1，siRNA－EMMPRIN－ 2 序列轉染組為實驗組2，按Trizol 試劑盒說明書分別提取轉染48 h 后上述三組細胞的總RNA。RT－PCR 反應參照RT－PCR 試劑盒說明書進行操作，引物由英駿生物技術有限公司合成，EMMPRIN 基因引物序列如下。

Forward primer:5'－CTCTGAGGACAAGGCCCTCATGAAC－3';Reverse primer:5'－CCGGCGCTTCTCGTAGATGAAGATG－3';擴增片段長度268 bp，Tm:60 ℃。

人內參GAPDH 引物序列如下:Forward primer:5'－GCCACATCGCTCAGACAC－3';Reverse primer:5'－CATCACGCCACAGTTTCC－3';擴增片段長度614 bp，Tm:59 ℃。

PCR 反應結束，取10 μl PCR 產物與上樣緩沖液混勻，加入2% 的瓊脂糖凝膠梳孔行電泳。取DNA marker 進行電泳，作為標準分子量的參照。80 V 恒定電壓下行電泳45 min 后，將凝膠電泳置入凝膠分析儀暗箱中拍攝凝膠電泳圖像。

1.2.3 Western blot 檢測EMMPRIN 的表達 分別收集轉染后48 h 的siRNA－negative control 序列轉染組，siRNA－EMMPRIN－1 序列轉染組，siRNA－EMMPRIN－ 2 序列轉染組細胞，用4 ℃預冷的PBS漂洗3 次后加入200 μl 細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白，每個樣本有效超聲3 次后，加入5 ×SDS 凝膠加樣緩沖液，沸水浴5 min，每孔加樣20 μl 行12%十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用5%脫脂奶封閉1 h 加入一抗，4 ℃過夜，加入二抗室溫下孵育1 h，化學法發光，膠片顯色，分析結果。以tubulin 作為內參照。

1.2.4 甲基噻唑基四唑法(MTT 法)檢測細胞增殖 U251 細胞消化制成單細胞懸液，以含10% FBS的DMEM 培養液調整濃度至(1 ～5)×105個/ml，取上述細胞懸液200 μl 至96 孔細胞培養板中培養12 h 后，進行小分子干擾片段轉染，每組設6 個復孔。96 孔細胞培養板周圍32 個孔舍棄，不加試劑。6 h 后更換10% FBS 的DMEM 培養液，37°C，5%(v/v)CO2飽和濕度恒溫培養箱中培養。倒置顯微鏡下觀察細胞形態。分別于培養12、24、48 h 后，吸干培養液，以PBS 漂洗2 遍后，每個孔中加入5mg/ml 的MTT 20 μl，同樣條件下培養4 h 后吸干，可見黑色結晶，終止培養。再于每個孔中加入200 μl 的DMSO，避光振蕩溶解10 min，并設定空白對照孔，調零，酶標儀檢測波長490nm 時各孔的吸光值(A490)。

1.2.5 流式細胞技術(FCM)檢測細胞周期 收集轉染48 h 后6 孔培養板中的siRNA－negative control 序列轉染組，siRNA－EMMPRIN－1 序列轉染組，siRNA－EMMPRIN－ 2 序列轉染組細胞，制成單細胞懸液，調整細胞至(1 ～5)×106個/ml。加入3 ml 預冷的PBS 重懸細胞，800 r/min ×5 min，吸凈上清。加入500μl PBS，輕輕重懸細胞，使細胞分離為單個，逐滴加入預冷的100%乙醇(－20℃)1.5 ml，使其終濃度為75%，－20 ℃放置過夜固定。取出固定樣本，800 r/min×5 min，棄上清。加入3 ml 預冷的PBS 重懸細胞，800 r/min×5 min，離心收集細胞，除去乙醇。加入150 μl RNaseA 重懸細胞，室溫靜置10 min，加入150 μl PI 工作液，4℃避光染色30 min。轉至流式檢測管:上機檢測，PI 用488 nm 氬離子激光器激發，由630 帶通濾光片接收，通過FSC/SSC 散點圖收集10 000 個細胞，采用設門技術排除粘連細胞和碎片，分析PI 熒光直方圖上細胞各周期及凋亡細胞的百分率。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0 統計軟件包進行分析處理。多組間比較采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EMMPRIN－siRNA 小片段轉染U251 細胞后EMMPRIN 基因mRNA 及蛋白的表達 如圖1 與圖2 中結果顯示，轉染EMMPRIN－siRNA 小分子干擾片段后，相對于陰性對照組，實驗組1 和實驗組2 中U251 細胞EMMPRIN 基因的mRNA 及蛋白表達均顯著下調。

2.2 EMMPRIN 基因表達下調導致U251 細胞增殖抑制 在轉染EMMPRIN－siRNA 小分子干擾片段12 h，24 h 及48 h 后，實驗組1、實驗組2 與陰性對照組相比細胞增殖明顯受到抑制(P ＜0.05，表1)。

表1 各組U251 細胞MTT 檢測結果(n=5;±s)

表1 各組U251 細胞MTT 檢測結果(n=5;±s)

注:各時間點MTT 檢測結果與陰性對照組相比，①P ＜0.05

時間點陰性對照組實驗組1實驗組2 12 h0.1176±0.011 0.1061±0.008① 0.1022±0.013①24 h0.5913±0.009 0.3902±0.012① 0.3889±0.011①48 h0.8861±0.013 0.5838±0.011① 0.5756±0.012①

2.3 EMMPRIN 基因表達下調導致U251 細胞凋亡增加 EMMPRIN－siRNA 轉染U251 細胞，實驗組1細胞的凋亡率為(6.0 ±0.7)%，實驗組2 細胞的凋亡率為(6.4 ±1.0)%，陰性對照組細胞的凋亡率為(2.7 ±0.6)%，實驗組1、實驗組2 細胞的凋亡率與陰性對照組細胞的凋亡率相比明顯升高(P ＜0.05)，差異有統計學意義。

2.4 EMMPRIN 基因表達下調對U251 細胞的細胞周期分布的影響 如前述方法將EMMPRIN－siRNA 小分子干擾片段轉染U251 細胞，在轉染48 h 后進行PI 染色，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。結果顯示:EMMPRIN－siRNA 轉染U251 細胞，細胞的周期分布發生顯著變化，實驗組1、實驗組2 和陰性對照組細胞S 期細胞比例分別為(28.1 ±2.6)%，(29.1 ±2.9)%，(45.1 ±3.1)%，經過統計學分析實驗組1、實驗組2 細胞的S 期細胞比例與陰性對照組細胞的S 期細胞比例相比明顯降低(P ＜0.05)，差異有統計學意義。

3 討論

EMMPRIN 是免疫球蛋白超家族中的一個成員，正常時僅在有限的幾種細胞(上皮細胞、生殖細胞、左心室心肌細胞、腦血管內皮細胞［1］)表達，而在腫瘤組織中廣泛的高表達。在正常生理條件下，EMMPRIN 參與創傷愈合、組織修復、妊娠和胚胎發育等眾多的生理過程。同時，EMMPRIN 基因表達對于腫瘤細胞的增殖、腫瘤血管的形成和化療抵抗均起到重要作用。Sameshima 等［2］對人腦膠質瘤與EMMRPIN 基因關系的研究顯示，與正常腦組織相比，EMMPRIN 基因在人腦膠質瘤中高表達，并且與腫瘤的惡性程度成正相關，EMMPRIN 基因在膠質瘤的發生，發展過程中起重要的作用。

Zucker 等［3］研究發現，通過轉染EMMPRIN 的cDNA 到乳腺癌細胞MDA－MB436 中后，細胞在裸鼠體內的增殖能力迅速提高，其機制在于EMMPRIN介導的MMP－2 和MMP－9 的生成，加速降解細胞外基質而使腫瘤細胞生長加速。Han 等［4］通過RNA 干擾沉默人前列腺癌細胞和人膀胱癌細胞EMMPRIN 表達，發現上述細胞的體內生長和增殖能力明顯降低。本實驗結果顯示，下調U251 細胞中EMMPRIN 的表達能夠有效抑制細胞的增殖，首次證實了EMMPRIN 基因在膠質瘤中也是起到促進腫瘤細胞增殖的作用，與在其他惡性腫瘤中作用一致。筆者通過流式細胞技術檢測細胞周期，發現下調U251 細胞中EMMPRIN 基因的表達使細胞周期分布發生改變，S 期細胞比例顯著減少，使細胞有絲分裂減少，從而抑制細胞的增殖。這說明下調EMMPRIN 基因的表達可能是通過影響細胞有絲分裂從而抑制細胞增殖。Tang 等［5］研究發現，EMMPRIN 在乳腺癌中促進腫瘤細胞增殖的機制在于EMMPRIN 介導的MMP－2 和MMP－9 的生成，加速降解細胞外基質而使腫瘤細胞生長加速。Baba等［6］研究證實，通過抑制EMMPRIN 的表達影響腫瘤細胞的能量代謝，從而抑制腫瘤的增殖。Xiang等［7］的研究證實，EMMPRIN 基因表達下調能夠有效抑制惡性黑色素瘤細胞在體外和裸鼠體內的增殖，認為可能的機制是EMMPRIN 基因表達下調能夠有效抑制VEGF 的表達，使腫瘤的生長受到抑制。筆者考慮EMMPRIN 基因促進膠質瘤細胞增殖可能也是依靠上述機制。

Marrieb［8］在對EMMPRIN 與乳腺癌系細胞株凋亡的關系研究中發現:將EMMRPIN 基因導入到腫瘤細胞中，腫瘤細胞凋亡明顯減少，其機制是EMMPRIN 主要是促進腫瘤細胞的錨著非依賴性生長，從而對抗細胞失巢凋亡。并且腫瘤細胞這種錨著非依賴性生長是與P13K 與ErK 兩種細胞存活信號通路的活化是密切相關的。本實驗結果顯示，下調人腦膠質瘤U251 細胞株中EMMPRIN 基因的表達，能導致細胞凋亡率明顯升高，與在乳腺癌等其他惡性腫瘤中所得結果一致。結合EMMPRIN 基因在其他惡性腫瘤中對抗細胞凋亡的機制研究結果，筆者考慮EMMPRIN 基因在膠質瘤中可能也是通過某種細胞存活信號通路的活化對抗細胞凋亡，其具體機制有待進一步研究。

膠質瘤是最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，臨床早期診斷和預防困難，治療棘手，同時致殘率、病死率均極高。膠質瘤發生發展的具體機制未完全闡明是造成這一局面的主要原因。研究表明，分子遺傳學在膠質瘤發生、發展中起著巨大的作用。本實驗以EMMPRIN 基因為靶點，以人腦膠質瘤U251 細胞為研究對象，通過RNAi 技術，探討EMMPRIN 基因表達對人腦膠質瘤U251 細胞增殖、凋亡的相關性，為以EMMPRIN 基因為靶點的基因治療提供了理論基礎和實驗依據，為人腦膠質瘤的治療開辟了新的途徑。但EMMPRIN 基因在促進膠質瘤增殖，對抗細胞凋亡的具體機制有待進一步研究。

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［5］ Tang Y，Kesavan P，Nakada MT，et al.Tumor－stroma interaction:positive feedback regulation of extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN)expression and matrix metalloproteinase－dependent generation of soluble EMMPRIN［J］.Mol Cancer Res，2004，2(2):73－80.

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