蟾皮藥材質量標準研究＊

曹 蔚 李 瑛 段林瑞 劉媛媛 王 凱 王四旺

第四軍醫大學藥學系天然藥物學教研室（西安710032）

蟾皮為蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的干燥皮，最早記載于《本經逢原》，自古沿用至今。習稱“蛤吧皮”、“癩蟆皮”、“蟾蜍皮”、“蛤蟆皮”等。具有清熱解毒，利水消脹之效，用于癰疽、腫毒、瘰疬、腫瘤、疳積腹脹等。《本草綱目》中記載：“蟾蜍其皮為元黽，主治疸疬惡瘡、破癥結、腫毒、腸頭挺出和一切惡腫等”；《中藥大辭典》中記載：“蟾皮清熱解毒、消腫止痛，軟堅散結”。現代藥理研究發現，蟾皮水提物具有抗腫瘤作用[1]，脂溶性組分具有抑制心肌細胞膜ATP酶等作用[2]。臨床用于慢性氣管炎、惡性腫瘤及癰疽瘡瘍等治療。近年來有關蟾皮制劑質量標準的研究報道較多，但《中國藥典》尚未收載蟾皮；蟾皮藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分等常規項目的測定，活性成分的定性鑒別也未見報道。這些項目的含量與藥物的臨床療效、穩定性和安全性有密切關系。本研究對蟾皮的水分、總灰分、酸不溶性灰分等檢測項目及活性成分的定性鑒別、定量測定進行較為全面的研究，為建立和完善蟾皮的質量標準提供科學的參考。

1 材料

1.1 藥材 3批蟾皮藥材采集自陜西省內不同地區（漢中市、西安周至縣和藍田縣），2批購于河北安國、安徽亳州藥市，經本教研室鑒定為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮。

1.2 儀器 LC－2010AHT高效液相色譜儀（日本島津公司）；GZX－DH型電熱恒溫干燥箱（上海市躍進醫療器械一廠）；BL310型電子分析天平（德國Sartorius公司）；SX－4－10型箱式電阻爐控制箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHZ－D（III）型循環水真空泵（天津華鑫儀器有限公司）；SK250LHC超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；電子恒溫水浴鍋（北京化玻醫療器械有限公司）。

1.3 試劑 華蟾酥毒基對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號：200605）；酯蟾毒配基對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號：200507）；乙腈為色譜純；其他試劑均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 理化鑒別 取本品粉末0.1g，加甲醇5 mL，浸泡1h，濾過，濾液加對二甲氨基苯甲醛固體少量，滴加硫酸數滴，即顯藍紫色。

取本品粉末0.1g，加三氯甲烷5mL，浸泡1h，濾過，濾液蒸干，殘渣加醋酐少量使溶解，滴加硫酸，初顯藍紫色，漸變藍綠色。

2.2 薄層鑒別 取本品粉末0.5g，加乙醇10 mL，加熱回流30min，濾過，濾液置10mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取華蟾酥毒基對照品加乙醇分別制成每1mL含0.5mg的溶液，取酯蟾毒配基對照品加乙醇分別制成每1mL含0.2mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜（TLC）法試驗，吸取上述四種溶液各10μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環己烷－三氯甲烷－丙酮（4︰3︰3）為展開劑，展開，取出，晾干，紫外下檢測，如圖1。再噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的一個綠色及一個紅色斑點。

圖1 蟾皮的TLC

2.3 水分及灰分測定

2.3.1 水分 按照《中國藥典》（2010年版）一部附錄IX H第一法進行測量[3]。稱取蟾皮粉末（過2號篩）約2g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，打開瓶蓋在100～105℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定，再在上述溫度干燥1h，冷卻，稱重，至兩次稱重的差異不超過5mg為止。根據減失的重量，計算供試品中含水量（%）。結果見表1。5批蟾皮藥材中水分含量平均值為10.99%。

2.3.2 總灰分 按照《中國藥典》（2010年版）一部附錄IX K第一法進行測量[1]。分別稱取蟾皮粉末約3g，置灼燒至恒重的坩堝中，放入電阻爐中，緩緩灼燒，根據殘渣的重量，計算供試樣品中總灰分的含量，結果見表1。5個蟾皮樣品中總灰分量平均值為13.21%。

2.3.3 酸不溶性灰分 供試品先按2.3.2的方法步驟測定其總灰分，然后取所得的灰分，在坩堝中加入10mL稀鹽酸，水浴加熱10min，用50℃左右的熱水5mL將表面皿沖洗，沖洗液并入坩堝中，用無灰濾紙過濾，用熱水沖洗，殘渣連同濾紙一同放入坩堝中，干燥，放入電阻爐中，緩緩灼燒，直到溫度升至550℃，再灼燒8h，關閉電阻爐，過夜，取出坩堝，放置干燥器中30min，根據殘渣的重量，計算供試樣品中灰分的含量，結果見表1。5個測試樣品中酸不溶性灰分含量平均值為4.58%。

表1 蟾皮水分、總灰分、酸不溶灰分測定結果（n＝3）

2.4 華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（250 mm4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－0.5%磷酸二氫鉀溶液（50∶50，用磷酸調PH 3.2）；檢測波長：296nm；流速：1.0mL·min－1；柱溫：40℃；進樣量：20μL。理論塔板數按華蟾酥毒基峰、脂蟾毒配基峰計算應分別不低于4000。色譜見圖2。

圖2 蟾皮的HPLC

2.4.2 供試品溶液的制備 分別取蟾皮藥材，粉碎使其過2號篩。取細粉約500mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.3 標準曲線 取0.355mg·mL－1的華蟾酥毒基對照品溶液和0.215mg·mL－1的脂蟾毒配基對照品溶液，等體積混合，并梯度稀釋兩倍，制成華蟾酥毒基濃度為177.50、88.75、44.38、22.19、11.09、5.55、2.77μg·mL－1，脂蟾毒配基濃度為107.50、53.75、26.88、13.44、6.72、3.36、1.68μg·mL－1的混合標準品溶液。分別精密吸取20μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以濃度（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得華蟾酥毒基的回歸方程為：Y ＝17 478X＋14 095（r＝0.999 9），脂蟾毒配基的回歸方程為：Y＝18 863X＋9 439.9（r＝0.999 9）。結果表明，華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的濃度分別在2.77～177.50、1.68～107.50μg·mL－1范圍內與各自峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.4.4 精密度試驗 取蟾皮樣品連續進樣5次，測定峰面積。結果，華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積的RSD分別為0.31%、0.30%。表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復性試驗 取同一產地蟾皮樣品按2.4.2項下操作方法制備5份樣品溶液，進樣測定。結果，華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積的RSD分別為0.31%、1.01%。表明本實驗所用的方法重復性良好。

2.4.6 穩定性試驗 取同一產地蟾皮樣品按2.4.2項下操作方法制備樣品溶液，分別于0、1、2、4、8、12h測定峰面積，結果，供試品溶液中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基峰面積的RSD分別為0.65%、0.87%。表明華蟾酥毒基、脂蟾毒配基在12h內穩定。

2.4.7 加樣回收率 精密稱取已知含量的蟾皮樣品9份，精密加入不同量的對照品，按照2.4.2項下的方法制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率，結果見表2。平均回收率為98.80%，RSD為2.81%。

表2 加樣回收率實驗結果

2.4.8 樣品含量測定 按上述色譜條件測定5批蟾皮中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，見表3。

表3 蟾皮藥材中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

3 討 論 蟾酥（Venenum bufonis）為蟾蜍耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物，蟾皮為蟾蜍去除內臟后的干燥表皮。蟾酥、蟾皮及其制劑均在臨床廣泛應用，但化學成分及功能主治卻不盡相同。蟾酥的質量標準收載于《中國藥典》，但尚未收載蟾皮。蟾皮收載于《江西省地方藥材標準》及《江蘇省地方藥材標準》，但其質量標準相對簡單。故本研究參照《中國藥典》（2010年版）蟾酥的質量標準，對蟾皮藥材質量標準進行了進一步的補充研究，為本品炮制及含制劑的生產與研發提供參考。

根據《中國藥典》（2010版）一部中蟾酥藥材水分含量測定的方法，考慮到目前未有蟾皮中含有揮發油的文獻報道，而《中國藥典》水分含量測定第一法（烘干法）測定水分方法簡單，操作易行，因此本文采用此法對蟾皮的水分進行測定。

在本品的理化鑒別試驗中，參照文獻[4]對含有2’6－去氧糖組成的強心苷類成分進行顯色反應，反應迅速、顏色明顯。此外，筆者還將供試溶液點于濾紙片上，干燥后，噴對二甲氨基苯甲醛試劑（1g對二甲氨基苯甲醛溶于l00mL乙醇中，再加25mL鹽酸混合而成），于90℃加熱半分鐘可顯灰紅色斑點，因重現性差，故不推薦列入質量標準。

蟾皮中富含蟾毒配基類化合物。其中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量相對較高。故在我們的研究中選擇以華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量做為蟾皮的檢測指標，參考《中國藥典》（2010年版一部）蟾酥項下方法進行鑒別，以期達到控制蟾皮質量的目的。但由于大多供試品中酯蟾毒配基未檢出。結合含量測定結果，考慮到蟾皮中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量遠低于蟾酥的實際，故不推薦華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的薄層鑒定列入質量標準。

[1]孫凌飛，申文江.蟾皮提取液對腎癌細胞凋亡及Fas、FasL和bcl－2表達的影響[J].中國醫藥導刊，2000，2（5）：32－33.

[2]陳才法，李景輝，鄭維發，等.蟾酥、蟾皮、蟾衣提取物對心肌細胞膜 ATP酶的影響[J].四川動物，2008，27（3）：393－395.

[3]國家藥典委員會.中國藥典（一部）[S].北京：化學工業出版社，2010：附錄52.

[4]國家藥典委員會.中國藥典（一部）[S].北京：化學工業出版社，2010：360.7