HPLC法測定新益腎蠲痹丸中延胡索乙素含量

王 偉

(江蘇正大清江制藥有限公司，江蘇 淮安 223005)

0 引言

新益腎蠲痹丸(濃縮丸)是在益腎蠲痹丸的基礎(chǔ)上研制的新藥，益腎蠲痹丸收載于《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》01冊39頁，標(biāo)準(zhǔn)號為 WS－68(Z－10)－92(Z)，由生地黃、熟地黃、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、延胡索、土鱉蟲等十九味藥組成，溫補(bǔ)腎陽，益腎壯督，搜風(fēng)剔邪，蠲痹通絡(luò)，用于風(fēng)濕及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。延胡索為本方中起止痛作用的主要成分之一，綜述了延胡索乙素的常用測定方法，包括薄層色譜法，RP－HPLC，HPLC法等。本研究建立了HPLC法測定新益腎蠲痹丸(濃縮丸)中延胡索乙素的含量，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好。原標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層掃描法測定延胡索乙素的含量，方法操作繁瑣，含量重現(xiàn)性差。

1 儀器與試藥

惠普HP1100高效液相色譜儀。

延胡索乙素對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號:0726－200208供含量測定用);新益腎蠲痹丸(濃縮丸)為江蘇正大清江制藥有限公司自制，批號為:05112301、05112502、05112703、06121101。

甲醇、乙腈均為色譜純;石油醚(60～90℃)、氨水、醋酸銨、冰醋酸均為分析純;水為自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

對照品溶液的制備:精密稱取延胡索乙素對照品6.48mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液(0.2592mg/ml)。精密吸取對照品貯備液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(25.92μg/ml)。

供試品溶液的制備:取本品研細(xì)，取約4g，精密稱定，置平底燒瓶中，加入濃氨試液5ml浸潤，加石油醚(60～90℃)在水浴上加熱回流提取3次，每次加入石油醚(60～90℃)50ml，回流 30分鐘，取下，放冷，濾過，用石油醚(60～90℃)10ml分兩次洗滌殘?jiān)?，洗液并入濾液中，減壓濃縮至干，用甲醇溶解殘?jiān)哭D(zhuǎn)移至10ml量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

陰性供試品溶液的制備:按本品處方及工藝制備延胡索缺味樣品，照供試品溶液的制備方法處理，作為陰性供試品溶液。

2.2 提取溶劑的考察

稱取本品，置平底燒瓶中，分別加入不同的溶劑各50ml，水浴上加熱回流30min，濾過，蒸干，照下表中所列方法進(jìn)行操作、測定，結(jié)果見表1。

表1 提取溶劑考察結(jié)果

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，用80%乙醇回流提取后，再用乙醚萃取與氨水－石油醚直接提取的含量結(jié)果無明顯差異，但乙醚萃取的操作復(fù)雜，且雜質(zhì)多，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，采用氨水－石油醚直接提取的方法。加熱回流時間對含量結(jié)果有影響，隨著加熱時間的延長而含量降低，最終采用提取3次，每次回流時間為30分鐘。

2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil(4.6×250mm不銹鋼柱，5μm)，流動相為甲醇－乙腈－1%醋酸銨緩沖液(pH=5.0±0.02)(10∶30∶60)，流速:1.0ml/min，柱溫 30℃，檢測波長 283nm，進(jìn)樣量15μl。

上述色譜條件下，色譜圖見圖1～圖3。

圖1 陰性對照溶液

圖2 對照品溶液

圖3 供試品溶液

2.4 線性范圍的考察

分別精密量取延胡索乙素對照品貯備液(0.2592mg/ml)0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別進(jìn)樣15μl，記錄色譜圖，讀取峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)樣量在0.07776～1.5552ug之間時，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y=893.02Χ－4.5035，相關(guān)系數(shù) r=0.9999。

2.5 精密度試驗(yàn)

取供試品(批號為:050615)，按該法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積;其結(jié)果RSD=1.54%(n=6)。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品(批號為:050615)，按法處理制得供試品溶液，分別取對照品和供試品溶液20ul，分別于2、4、8、12、24 小時，結(jié)果對照品與供試品其 RSD 值均＜2%。表明對照品溶液室溫放置24小時內(nèi)和供試品溶液在室溫放置12小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取本品(批號為:050615)，研勻，精密稱取6份，按樣品的含量測定方法處理，進(jìn)行測定，X=0.085mg/g，RSD=1.79%(n=6)。結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取本品(批號為:050615)約2g，置平底燒瓶中，加入0.5 ml延胡索乙素對照品儲備溶液(0.3336mg/ml)，以下照含量測定法處理;依法操作，制備6份供試品溶液，進(jìn)樣，測定，計(jì)算回收率，平均加樣回收率為99.6%，RSD為1.91%(n=6)。

2.9 樣品的測定

取三批放大樣品，批號為 05112301、05112502、05112703及藥檢所送檢樣品06121101的新益腎蠲痹丸，按該法測定延胡索乙素含量，記錄色譜圖，結(jié)果見表2。

表2 四批樣品含量測定數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

采用HPLC法，以甲醇－乙腈－1%醋酸銨緩沖液(pH=5.0±0.02)(10∶30∶60)為流動相，檢測波長為283nm測定延胡索乙素含量，方法簡便可行，結(jié)果準(zhǔn)確。

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