雷帕霉素對膿毒癥大鼠肝損害的保護作用

尹建亞 湯石林 彭登高 謝黎明 卿國忠

膿毒癥（sepsis）通常導致多器官功能衰竭（MODS），而肝臟損害是膿毒癥MODS的最常見表現。研究發現，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等炎癥因子的過量釋放是膿毒癥誘發肝臟損害的關鍵因素[1]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（The mammalian target of rapamycin, mTOR）是調節細胞增殖、凋亡等的重要信號蛋白，近來研究發現其在炎癥反應的病理生理過程中扮演重要角色[2]。Kimball等[3]發現，在膿毒癥誘發肝損害中mTOR起著重要作用。雷帕霉素是與mTOR結合并使其失活的臨床常用免疫抑制劑，其能否減輕膿毒癥所致肝臟損害目前尚不明確[4]。本試驗擬建立膿毒癥大鼠肝損害模型，觀察雷帕霉素對肝臟損害的保護作用及其機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 50只Wistar雄性大鼠，購自南華大學實驗動物中心，隨機分成三組：假手術組（10只）、膿毒癥+雷帕霉素組（20只）和膿毒癥+PBS組(20只)。雷帕霉素購自華北制藥集團（1mg/mL），按1mg/kg/d在實驗前2h進行灌胃處理。

1.2 膿毒癥模型制作 參照金惠銘的方法[5]，采用盲腸結扎穿刺法（CLP）制作膿毒癥模型。大鼠經乙醚麻醉后，常規消毒腹部，經正中切口打開腹腔后小心分離盲腸，然后用3號絲線環形結扎盲腸。結扎完畢后仔細檢查腸道通暢情況。在與腸系膜相對的盲端腸壁漿膜面用9號針頭穿刺二次（針孔間距約3mm），第一針孔距盲端約3mm。輕輕將腸道放回原處，關閉腹腔并縫合后補充生理鹽水（5mL/100g體重）。假手術組打開腹腔，但不進行CLP處理。

1.3 肝臟功能生化指標檢測 從大鼠眼眶取血約2mL，離心后予-20℃冰箱凍存，采用終點法檢測不同時間點血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平。

1.4 炎癥因子水平的檢測 采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清TNF-α和IL-6的水平。按說明書方法，將100μL血清樣品和標準品加入板孔，蓋上封板膜后室溫孵育1h。洗板3次后加入生物素標記TNF-α和IL-6抗體，經過溫育、洗滌、顯色等過程后，用450nm波長讀OD值，繪制標準曲線，求出TNF-α和IL-6濃度。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0軟件對數據進行分析，數據以（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雷帕霉素對大鼠ALT和AST水平的影響 假手術組大鼠不同時間點（3、6、12、24h）血清ALT和AST濃度較低。CLP術后，血清ALT和AST濃度迅速升高，ALT于24h到達高峰，AST于12h到達高峰。使用雷帕霉素處理后，血清ALT和AST水平相對于CLP+PBS組明顯降低，兩組在不同時間點（6、12、24h）差異存在顯著性（P<0.05)（如圖1所示）。

圖1 大鼠血清ALT和AST表達的變化（CLP+雷帕霉素vs CLP+PBS，aP＜0.05)

2.2 雷帕霉素對大鼠TNF-α和IL-6表達水平的影響 假手術組大鼠不同時間點（3、6、12、24h）血清TNF-α和IL-6表達水平較低。CLP術后，血清TNF-α和IL-6濃度迅速升高，于12h到達高峰。使用雷帕霉素處理后，血清TNF-α和IL-6水平相對于CLP+PBS組明顯降低，兩組在不同時間點（6、12、24h）差異存在顯著性（P<0.05)（如圖2所示）。

圖2 大鼠血清TNF-α和IL-6水平的變化（CLP+雷帕霉素vs CLP+PBS，aP＜0.05)

3 討論

膿毒癥主要是由感染因素引起的全身炎癥反應，炎癥因子的過度釋放在其病理生理過程中起著重要作用[6]。炎癥因子通過與其受體結合，激活胞內信號途徑，直接參與對多種組織細胞的損傷過程。膿毒癥易并發MODS，肝臟損害是其主要表現。在本實驗中，我們采用CLP術建立了大鼠膿毒癥模型，結果發現膿毒癥大鼠肝細胞損傷的指標ALT和AST水平明顯增高，這與其他文獻的報道一致[1]。主要促炎因子TNF-α和IL-6在膿毒癥并發MODS中發揮了重要的作用，我們發現CLP術后3h大鼠血清的TNF-α和IL-6水平顯著增高，提示TNF-α和IL-6可能參與了膿毒癥大鼠肝臟的損傷。

mTOR是哺乳動物細胞合成的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,能夠整合細胞內多條信號途徑，參與細胞的增殖、分化及對免疫炎癥的調節作用[7]。在膿毒癥動物模型中，研究者發現mTOR信號被激活，并參與了肝臟和骨骼肌組織中多種炎癥因子的釋放[3]。雷帕霉素通過與FKBP12組成復合物，抑制mTOR的活性[2]。在本研究中，相對于PBS組，雷帕霉素組血清ALT和AST的水平明顯降低，提示雷帕霉素對膿毒癥大鼠肝臟損害具有保護作用。雖然雷帕霉素對膿毒癥大鼠肝臟損害的保護作用機制還有待進一步探討，但雷帕霉素下調血清TNF-α和IL-6的水平，提示抑制炎癥反應可能是其肝臟保護的作用機制之一。張元晴等[8]發現雷帕霉素通過抑制淋巴細胞增殖抑制刀豆素A誘發的肝臟損害及其炎癥反應。Fielhaber等[9]發現雷帕霉素通過抑制核因子kB（NF-kB）的激活下調肺臟炎癥因子的表達。雷帕霉素是否通過調節淋巴細胞增殖、NF-kB激活或者直接抑制mTOR活性來降低膿毒癥大鼠肝臟損害和炎癥反應將在后續研究中進一步探討。

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