檉柳類鋅指基因ThZFL的功能分析1)

曲冠證 鄭唐春 杜兆偉 趙思雯 夏德安

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業大學)，哈爾濱，150040)

檉柳(Tamarix hispida)是分布在干旱荒漠區域的抗脅迫性較強的生態植物，除具有抗干旱能力外，還主動將積累的鹽分儲存在液泡中而實現區隔化［1－2］。因此，檉柳是進行林木抗逆研究的理想物種。通過對檉柳cDNA文庫的測序及Blast比較分析，獲得了一個具有完整開放讀碼框的基因序列(GenBank No.EG971462)，其與擬南芥中命名為C2H2 型鋅指蛋白(AT5G16470，AT3G02790，TAIR)的基因具有較高的相似性(氨基酸序列相似性約為80%)。植物鋅指蛋白是一類廣泛研究的抗逆性基因蛋白，例如在胡椒中克隆的新基因CaAbsi1、從菊花中分離的DgZFP基因和鋅指蛋白基因Tsip1轉煙草中都對NaCl、干旱、冷凍及激素等脅迫產生應答反應［3－5］。但通過對 SwissProt數據庫進行 Blast未發現有相似的已知植物蛋白基因，因此可以認為此基因為一個新基因，故暫時命名該基因為ThZFL(Tamarix hispida Zinc finger like gene)［6］。

本試驗在前期的試驗基礎上，對轉基因煙草植株進行鹽脅迫、干旱脅迫處理，探究ThZFL基因在應對非生物脅迫的生理功能。通過酵母雙雜交技術，篩選與ThZFL基因表達的蛋白具有相互作用的蛋白，為研究蛋白質與蛋白質間的相互聯系提供支持，也為探究新基因的生理功能提供理論依據。通過克隆ThZFL基因的啟動子，轉化擬南芥分析表達規律，為進一步探究該基因的生理功能、分析抗逆機制的形成提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用煙草野生型為Nicotiana tabacum‘Havana SRI’;擬南芥野生型為 Columbia－0 型;酵母雙雜交表達載體pGBKT7－BD、對照質粒pGBKT7－53、pGBKT7－lam、pGADT7－T、Y2Hgold 和 Y187 酵母菌種，酵母省缺培養基及轉化試劑均購自Clontech公司;PCR相關試劑、DNA marker、pMD18－T載體、限制性內切酶、T4 DNA ligase均購自TaKaRa公司(中國，大連);EasyPure Plant RNA Kit(Transgen，中國);其他試驗試劑為進口或國產分析純。

1.2 ThZFL基因轉煙草的非生物脅迫分析

鹽脅迫下種子的發芽率 將收獲的轉基因煙草種子消毒后點種到含有200 mmol/L NaCl MS培養基中，放到培養室中從第7天起開始統計發芽率，以野生型煙草種子為對照。

鹽脅迫下葉片的分化情況 將轉基因煙草組培苗的葉片切成1 cm×1 cm的小塊，轉移到含有200 mmol/LNaCl的MS分化(MS+0.5mg/L6－BA+0.05 mg/L NAA)培養基上，觀察葉片的分化情況，以野生型煙草葉片為對照。

鹽及干旱脅迫下植株的生長狀況 將3周大小的轉基因煙草7、16、20、21號株系幼苗種植到土壤中，壯苗一周后，用200 mmol/L的NaCl溶液澆灌煙草植株，每隔3 d澆水一次。在處理后的第3天、第7天、第14天測量植株高度。40 d后將煙草植株用清水洗凈，晾干后測量鮮質量，烘干后測量干質量;同時，另一組一直不澆水，進行干旱處理，觀察20 d后的生長狀況。

ThZFL基因互作蛋白的篩選 從檉柳cDNA文庫中克隆出ThZFL目的基因序列，用 BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶雙酶切后連接到pGBKT7－BD載體中，獲得重組質粒pGBKT7－ThZFL。轉化酵母Y2Hgold菌株，對轉化后的酵母涂布 SD/－Trp、SD/－Trp/X、DDO、TDO平板，驗證目的基因無自激活作用，通過對酵母生長曲線的測定驗證誘餌蛋白無毒性作用［7］。將活化好的含有誘餌表達載體的Y2Hgold菌，與構建好的檉柳酵母文庫Y187菌進行酵母雜交，然后涂布TDO平板。3 d后挑取三缺板上的單克隆轉移到QDO/X/A平板，初步檢驗陽性克隆。從酵母中營救質粒轉化大腸桿菌，送北京六合華大公司測序。

ThZFL基因啟動子的克隆及其表達分析 用CTAB法提取檉柳基因組DNA［8］，根據已知的ThZFL基因序列設計3條特異引物:Th－SP1/Th－SP2/Th－SP3(表1)，設計方向為需要擴增的未知區域。以檉柳基因組DNA為模板，分別以AP1、AP2、AP3、AP4引物為上游引物。根據染色體步移試劑盒(TaKaRa)說明書進行3輪PCR。將PCR產物膠回收后連接pMD18－T載體，送北京六合華大公司測序。根據啟動子序列設計啟動子特殊引物Th－PF/Th－P－R(表1)，用限制性內切酶 NcoI和 Hind III將啟動子剪切后連入NcoI和Hind III內切酶處理的pCAMBIA－1301載體中，構建植物表達載體p1301－PThZFL－gus。然后轉入農桿菌EHA105菌中，采用浸花法侵染野生型擬南芥，獲得轉p1301－PThZFL－gus擬南芥植株［9］。

表1 ThZFL基因啟動子克隆引物匯總

播種轉基因種子后，在幼苗期取材，放入GUS染色液中在37℃染色10 h，然后用卡諾固定液(V(無水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)脫色并拍照［10］。GUS染色液配制如下:100 mmol/L sodium phosphate、pH=7.0，1 mmol/L 5－bromo－4－chloro－3－indolyl－β－D－glucuronide，0.5 mmol/L potassium ferrocyanide，0.5 mmol/L potassium ferricyanide，10 mmol/L Na2EDTA and 0.1%Triton X－100。用透明劑(V(水)∶V(甘油)∶V(乳酸)∶V(苯酚)=1∶1∶1∶2)處理擬南芥幼苗后，放在Zeiss熒光實體顯微鏡下進行觀察。

2 結果與分析

2.1 ThZFL基因轉煙草的非生物脅迫分析

2.1.1 鹽脅迫下轉基因煙草種子發芽率

將種子種在含有200 mmol/L NaCl的培養基上培養7 d后，統計其發芽率，結果如表2和圖1A。非脅迫條件下，野生型和轉基因煙草種子的發芽率幾乎都為100%，差異不大。200 mmol/L NaCl脅迫后，發芽率差異較大。轉基因煙草種子各株系發芽率降低，為60%左右，而野生型煙草種子的發芽率降到10%左右。以上結果表明，ThZFL基因的過表達提高了轉基因煙草種子的抗鹽能力。

表2 ThZFL轉煙草種子發芽率

2.1.2 鹽脅迫下轉基因煙草離體葉片生長情況

將轉基因煙草葉片在含有200 mmol/L NaCl的分生培養基上培養，1個半月后觀察的結果如圖1B。野生型煙草在脅迫初期是緩慢進行分化的，但隨著時間的變化，野生型煙草葉片逐漸褐化，喪失分化能力，最后死亡;而轉基因煙草葉片則能在含鹽的分化培養基上繼續分化生長。這些結果表明，ThZFL基因的過表達提高了轉基因煙草葉片的抗鹽能力。

2.1.3 鹽及干旱脅迫下轉基因煙草植株的生長情況

轉基因煙草植株在鹽和干旱脅迫下的結果如圖2。在200 mmol/L NaCl處理后，轉基因煙草長勢高于野生型一倍左右(表3)，在處理40 d后，轉基因煙草的葉片和莖比野生型煙草鮮艷，葉綠素含量更高;通過對根的比較發現，受脅迫后，野生型煙草的根系發育遲緩，根系不如轉基因植株發達，側根條數較少，根部出現萎蔫現象(圖2A);通過脅迫后植株的鮮質量和干質量比較發現，轉基因植株與野生型植株的相對含水量差異不大，但轉基因株系根干質量比野生型的高2～3倍，與圖2A中根系發達程度相近(表4)。干旱脅迫20 d后，轉基因株系比野生型植株抗旱能力稍強一些，轉基因煙草植株比野生型茁壯，葉片保綠保水程度更高一些，復水24 h后植株恢復能力更強(圖2B)。以上結果說明，ThZFL基因的過表達提高了轉基因煙草植株的抗鹽、抗旱能力。

圖1 ThZFL轉煙草的鹽脅迫試驗

表3 ThZFL轉煙草200 mmol/L NaCl處理植株長勢

表4 ThZFL轉煙草200 mmol/L NaCl處理的植株質量

圖2 ThZFL轉煙草植株的脅迫試驗

2.2 與ThZFL蛋白互作蛋白的篩選

誘餌 Y2Hgold(pGBKT7－ThZFL)和檉柳文庫Y187(pGADT7－library)酵母雜交后，涂布TDO平板，長出單克隆后進行菌落PCR。PCR結果顯示，目的基因的長度為500～1 000 bp(圖3A)。然后轉移到QDO/X/A平板上，初步篩選到10多個陽性克隆(圖3B)。通過測序結果分析，陽性克隆多為重復序列。最后檢測得到一個與誘餌(pGBKT7－ThZFL)互作的蛋白。通過酵母雙雜交試驗以及進一步的雙雜交驗證，確認這個基因是與ThZFL互作的蛋白。此基因開放讀碼框長度為462 bp，可預測編碼153個氨基酸序列(圖3C)。

2.3 ThZFL基因啟動子的克隆

利用染色體步移法經過3輪PCR后，電泳檢測到一條長度1 200 bp左右的片段，將該片段回收連接到pMD18－T克隆載體中，測序后通過序列比對分析，發現該序列與ThZFL基因的ORF的30個堿基序列一致，說明擴增得到的序列包含ThZFL基因的上游啟動子序列。用Bioedit軟件將序列拼接后，獲得1 185 bp的ThZFL的啟動子序列(圖4)。利用PLACE 數 據 庫 (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)，對獲得的 ThZFL啟動子序列進行分析。ThZFL啟動子含有7個元件:(1)TATA－box，RNA聚合酶Ⅱ結合的位點，是核心的啟動子元件。(2)CAAT－box，可能與轉錄的起始頻率有關，有增強基因轉錄的作用，是真核生物基因啟動子典型元件之一。(3)ARE元件:序列中含有1個ARE元件，與厭氧誘導有關。(4)CGTCA－motif和TGACG－motif:序列中含有5個，這兩種元件與茉莉酸(MeJA)誘導相關。(5)HSE元件:序列中含有1個HSE(heat stress element)元件，與熱反應相關。(6)GATA－motif、GT1－motif、LAMP－element和 Sp1:都是與光作用的順式元件。(7)TC－rich repeats:和防御與脅迫相作用的元件。

圖3 酵母雙雜交篩選互作蛋白

圖4 ThZFL基因啟動子的堿基序列

2.4 ThZFL基因啟動子在擬南芥中的表達模式

將檉柳ThZFL基因啟動子構建植物表達載體p1301－PThZFL－gus，用 ThZFL 啟動子驅動 GUS 基因在轉基因擬南芥中表達。轉基因植株GUS活性檢測表明:擬南芥幼苗幾乎整株表達(圖5A)，幼嫩的葉片和莖尖分生組織表達較弱(圖5B)，葉脈表達強一些(圖5C)，而老葉中GUS活性明顯減弱，同時還發現毛狀體中GUS表達較強(圖5D)。

圖5 ThZFL－Promotor轉擬南芥植株的GUS活性檢測

3 結論與討論

檉柳生長于環境惡劣的荒漠地區，在自然選擇的條件下，適應嚴酷條件的抗性基因得到富集與積累。例如，王玉成等［11］從檉柳中克隆到一個新的bZIP基因，在轉基因煙草中能增強過氧化酶(POD)和過氧化物歧化酶(SOD)的活動，并增加可溶性糖與可溶性蛋白質的含量;Guo XiaoHong等［12］從檉柳根系鹽脅迫cDNA文庫中分離出一個編碼冷凍適應蛋白基因ThCAP，轉基因楊樹對低溫具有較強的抵抗能力;最新研究表明，檉柳ThVHAc1轉酵母菌株能提高對鹽、干旱、紫外線、氧化劑、重金屬、冷凍和高溫的耐性［13］。所以從檉柳基因組中探究新基因的生理功能具有重要的經濟價值與生態意義。

酵母雙雜交是一種簡便快速研究蛋白質間相互作用的一種方法，與傳統的方法相比，其最大的優勢在于不用分離純化蛋白質，而是將所研究的基因置于真核酵母細胞體內表達目的蛋白，從而為蛋白的功能修飾提供一個場所。研究中從檉柳cDNA文庫中篩選出一個與ThZFL基因互作的基因序列，該基因也未見報道，其基因的功能將在以后進一步深入研究。

目前鋅指蛋白基因主要應用于植物抗旱、耐鹽、抗凍以及抗病研究上。Kim等［14］從大豆中克隆了一個鋅指基因ZPT223，然后轉染擬南芥和煙草后，能顯著提高轉基因植物抗干旱脅迫能力;Mukhopadhyay等［15］也從水稻中克隆了一個鋅指基因OSISAP1，轉基因煙草同樣表現出對干旱、鹽漬的抗性增強。Sakamoto等［16］克隆了擬南芥鋅指基因AZF1、AZF2、AZF3，發現這些基因在干旱、高鹽、冷和外源ABA的誘導下表達量增高。ThZFL基因啟動子驅動GUS基因表達，GUS活性顯示:該啟動子的表達部位在幼苗的整體、葉脈和毛狀體中表達顯著，但在莖尖生長點處表達微弱，推測ThZFL基因主要在成熟組織中發揮抗逆作用。

試驗結果顯示，轉檉柳ThZFL基因煙草對鹽漬、干旱等非生物脅迫具有顯著的增強效果，說明該基因可能參與植物逆境脅迫調節。盡管ThZFL基因的同源基因在擬南芥中被標注為鋅指基因，但實際上檉柳ThZFL基因完全不屬于鋅指蛋白基因家族，而是一個新基因［3］。

因為自然環境的原因，我國干旱、鹽堿地面積廣大，嚴重制約著農業、林業的發展。研究表明，植物抗鹽機制是錯綜復雜的，是受植物多基因控制的［17］，因此檉柳ThZFL基因在生物工程中作為一個優良的抗性基因，在農業、林業中或許可以起到重要的作用。

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