一株水貂阿留申病毒的分離鑒定及VP2基因序列分析1)

桑 宇 張段玲 錢毓斌 張彥龍

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

水貂阿留申病(Aleutian Ddisease，AD)是由阿留申病毒(Aleutian disease parvovirus，ADV)引起的水貂慢性傳染性疾病，主要侵害水貂的免疫系統(tǒng)，以漿細(xì)胞彌漫性增生和持續(xù)性病毒血癥為特征［1－2］。AD在有水貂飼養(yǎng)的國(guó)家普遍存在，臨床上主要表現(xiàn)為水貂產(chǎn)仔量降低、死胎、流產(chǎn)、腎小球腎炎、動(dòng)脈血管炎和肝炎，并導(dǎo)致成年水貂的免疫系統(tǒng)紊亂，仔貂突發(fā)嚴(yán)重肺炎而死亡［3］。病理剖檢常見(jiàn)腎腫大、充血而呈紅色，后變灰褐色或淡黃褐色，有的表面可見(jiàn)斑點(diǎn)狀出血，間有灰白色壞死灶［4］。水貂AD發(fā)病率約75%，直接死亡率可達(dá)30%［5］。病貂毛皮質(zhì)量下降，對(duì)水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［6－7］。

對(duì)流免疫電泳(CIEP)是現(xiàn)今世界公認(rèn)的并且應(yīng)用最為廣泛的AD檢測(cè)方法，通過(guò)CIEP檢測(cè)淘汰AD陽(yáng)性貂對(duì)貂群進(jìn)行凈化，是目前AD防控唯一有效的方法。雖然我國(guó)已經(jīng)研制出AD的CIEP診斷抗原，但由于我國(guó)水貂養(yǎng)殖方式和對(duì)AD危害認(rèn)識(shí)不足等原因，AD檢測(cè)凈化一直沒(méi)有得到廣泛的推廣。近年，國(guó)際毛皮市場(chǎng)的旺盛需求帶動(dòng)了我國(guó)水貂養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)大，但由于管理上的不完善等原因?qū)е挛覈?guó)水貂ADV感染率居高不下，初步統(tǒng)計(jì)ADV的感染率高達(dá)80%～90%。AD對(duì)我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的影響越來(lái)越嚴(yán)重，加強(qiáng)檢測(cè)凈化工作已經(jīng)逐漸被廣大養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)所認(rèn)識(shí)和接受。為了深入了解近年來(lái)我國(guó)ADV的流行情況，并利用當(dāng)前的流行毒株研制新的診斷抗原，筆者從送檢水貂樣本中分離出一株ADV(命名為ADV－ZYL1)，對(duì)其VP2序列進(jìn)行測(cè)定，基于氨基酸的同源性繪制分析表，闡明ADV－ZYL1毒株的抗原變異情況，為進(jìn)一步開展該病的診斷和防治研究奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

病料 山東威海養(yǎng)殖戶送檢的疑似ADV感染致死的水貂樣本，采集其實(shí)質(zhì)器官，置于－20℃保存。

試劑和細(xì)胞 蛋白酶K、PMD18－T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;胰蛋白酶、DMEM購(gòu)自Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、感受態(tài)大腸桿菌DH5α、小量膠回收試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;小牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司;貓腎傳代細(xì)胞系(CRFK)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù);ADV陽(yáng)性核酸為東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

引物 檢測(cè)用的特異性引物參考Qie等［8］的研究報(bào)告。上游P1:5'－CTTGTCACGCTACTAGAATGGT－3'(2 587 ～2 609 bp);下游 P2:5'－AGCTTAAGGTTAGTTTACATGGTTTACT－3'(3 252 ～3 279 bp)?？蓴U(kuò)增的目的DNA片段的長(zhǎng)度為693 bp。參考GenBank中保存的標(biāo)準(zhǔn)毒株ADV－G(M20036)核苷酸序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 6.0分別設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物，用于擴(kuò)增 VP2全序列。上游AD1:5'－TATTCAGCAAGCAAAAAAGAAG－3'(2 336～2 355 bp);下游 DV1:5'－TTGGTTGGTATGAGTTAAGTAG－3'(3 921～3 942 bp)。擴(kuò)增的目的片段命名為part.1，長(zhǎng)度為1 606 bp。上游 AD2:5'－TATTCAGCAAGCAAAAAAGAAG－3'(3 810～3 831 bp);下游 DV2:5'－TATTCAGCAAGCAAAAAAGAAG－3'(4 452 ～4 474 bp)。擴(kuò)增的目的片段命名為part.2，長(zhǎng)度為664 bp。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2 試驗(yàn)方法

2.1 DNA的提取及PCR檢測(cè)

取水貂部分臟器，用剪刀盡量剪碎，加入600 μL 的1×TNE(消化緩沖液)，40 μL 蛋白酶 K，80 μL 10%SDS，55℃消化過(guò)夜。向各試管加入720 μL的平衡酚(V(酚)∶V(氯仿)=1∶1的混合溶液)，震蕩搖勻成乳濁液，放置0.5 h，4℃條件下12 000 r/min離心15 min。取700 μL上清液加入等體積的異丙醇，搖勻靜置30 min，4℃條件下12 000 r/min離心15min，棄上清。沉淀用75%預(yù)冷乙醇洗滌，12 000 r/min離心5 min，棄上清，干燥后加入10～20 μL滅菌純水。溶解后以紫外分光光度計(jì)定量為1 g/L。檢測(cè)引物P1、P2的PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 3 min，94 ℃ 0.5 min，50 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。

2.2 病毒分離

將臟器置于研缽中并在冰上研碎，按研碎組織體積占據(jù)30%的比例加入DMEM制備組織懸液，懸液以12 000 r/min離心15 min，收集上清，以0.22 μm濾膜除菌后用于病毒的細(xì)胞培養(yǎng)。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)CRFK細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后傾去培養(yǎng)液，加入除菌組織懸液2 mL于31.8℃吸附2 h［9］，中間晃動(dòng)數(shù)次，傾倒出吸附液，然后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于二氧化碳恒溫箱中31.8℃培養(yǎng)，以3～4 d作為標(biāo)準(zhǔn)，盲傳至出現(xiàn)病變后收獲各代病毒培養(yǎng)物。

2.3 分離病毒的PCR檢測(cè)和VP2全基因序列克隆測(cè)定

對(duì)出現(xiàn)病變后收獲的各代病毒培養(yǎng)物提取DNA，12 000 r/min 離心15 min，棄上清，加入490 μL的1×TNE(消化緩沖液)，10 μL 蛋白酶K，55 ℃消化過(guò)夜，其余步驟同2.1。以引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。用兩對(duì)測(cè)序引物AD2、DV2和AD1、DV1分別對(duì)病毒分離前后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR采用25 μL體系。取2 μg DNA 作為模板，加入 10×Buffer 2.5 μL，上下游引物各1 μL、2.5 mmol/L 的 dNTP 2 μL、最后加0.5 μL 的 Taq 酶，用滅菌純水補(bǔ)足到25 μL。反應(yīng)結(jié)束后分別進(jìn)行電泳切膠回收，純化產(chǎn)物連接PMD18－T載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α，PCR檢測(cè)陽(yáng)性單克隆菌落送英駿公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定結(jié)果編輯后用MEGA4.1和GenBank中國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的水貂阿留申病毒VP2蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 病料的PCR初步檢測(cè)

提取幼貂臟器的DNA，并利用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在脾臟DNA中得到了與預(yù)期擴(kuò)增片段(693 bp)相符的核酸電泳帶，見(jiàn)圖1。

圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果

3.2 病毒分離

將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的脾臟碾磨過(guò)濾除菌，除菌后的組織懸浮液吸附于單層的CRFK細(xì)胞，31.8℃培養(yǎng)3代無(wú)明顯細(xì)胞病變，盲傳到第4代培養(yǎng)96 h后，細(xì)胞系出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞脫落，并有大量空斑，形成CPE(cytopathic effect)。繼續(xù)在31.8℃條件下培養(yǎng)到第10代，仍見(jiàn)大量空斑和明顯的CPE(圖2)，凍融收集培養(yǎng)液。

圖2 分離毒株感染CRFK細(xì)胞后第10代96 h的形態(tài)觀察

3.3 分離病毒的PCR檢測(cè)及VP2序列測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)物提取DNA后PCR檢測(cè)仍為陽(yáng)性(圖3)，對(duì)病毒分離前后提取的DNA分別用AD1、DV1和AD2、DV2兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到了預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，見(jiàn)圖4。切膠純化后克隆測(cè)序表明，分離前后病毒序列無(wú)變化，登陸基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)其測(cè)序結(jié)果，該結(jié)果與美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)毒株ADV－G的VP2核苷酸同源性為94.7%，進(jìn)一步證明了ADVZYL1為水貂阿留申病毒，而且此毒株可以在CRFK細(xì)胞中穩(wěn)定生長(zhǎng)。

圖3 病毒分離后培養(yǎng)液PCR檢測(cè)結(jié)果

3.4 ADV的VP2蛋白同源性比較

測(cè)序結(jié)果用DNAStar進(jìn)行編輯。將編輯后ADVZYL1毒株的VP2基因與GenBank中的國(guó)際毒株ADV－Far East(DQ371395)、ADV－FIN(GQ336866)、ADV－G(M20036)、ADV－LN1(GU183264)、ADV－LN2(GU183265)、ADV －LN3(GU269892)、ADV －SL3(X97629)、ADV－TR(U39013)、ADV－TR2(U39014)、ADV－Utah－1(Z18276)的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，ADV－ZYL1與其它亞型的毒株相比較，VP2蛋白氨基酸同源性為92.6% ～96.1%，其中與強(qiáng)毒力毒株ADV－Utah－1的親緣關(guān)系最近，與遠(yuǎn)東毒株ADV－Far East的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖4 病毒分離前后培養(yǎng)液PCR檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論與討論

本次試驗(yàn)病料來(lái)源于斷乳前發(fā)病死亡的幼貂，通過(guò)病理學(xué)剖檢發(fā)現(xiàn)，其具有明顯臟器病變，表現(xiàn)為肺臟出血性炎癥，腎臟腫大、表面有出血點(diǎn)。細(xì)菌培養(yǎng)、犬瘟熱病毒和水貂病毒性腸炎等檢測(cè)結(jié)果均為陰性。應(yīng)用已發(fā)表的特異性ADV引物進(jìn)行PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性，因此認(rèn)為幼貂由ADV感染致死。病料處理后在CRFK細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)10代后，獲得了穩(wěn)定毒株ADV－ZYL1。利用設(shè)計(jì)的擴(kuò)增VP2基因全序列的引物，分別對(duì)病料DNA提取物和病毒細(xì)胞培養(yǎng)物DNA進(jìn)行VP2基因的測(cè)序，序列分析結(jié)果顯示，分離前后VP2同源性為100%，進(jìn)一步驗(yàn)證了病毒分離結(jié)果的可信度。

表1 11株ADV的VP2基因的氨基酸序列同源性分析結(jié)果

ADV的VP2蛋白由VP2基因編碼而成，在病毒衣殼中占有絕大部分的比重，是其主要抗原決定簇載體［11－12］，可以引起中和抗體反應(yīng)［13］。人工表達(dá)的全VP2蛋白能獨(dú)立組裝成病毒衣殼，因此VP2基因的結(jié)構(gòu)決定了病毒的抗原性［14］。近幾年的研究還表明，真核、原核表達(dá)的VP2全序列或者VP2片段都可直接用于ELISA和CIEP檢驗(yàn)，表現(xiàn)出很好的抗原性［15］。對(duì)VP2核苷酸和氨基酸的研究有助于研究ADV抗原性，因此本次試驗(yàn)選擇了對(duì)ADV－ZYL1毒株的VP2全序列氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果表明:ADV病毒雖屬于細(xì)小病毒科，但是VP2蛋白的氨基酸突變率介于0.8%到8.8%之間，核苷酸突變率介于0.3%到7.7%之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同屬于細(xì)小病毒科的水貂腸炎病毒和犬細(xì)小病毒［16－17］，而且突變氨基酸位點(diǎn)不僅集中在超變區(qū)，還廣泛存在于保守區(qū)，這與之前的報(bào)道相一致［18］。ADV－ZYL1毒株與同源性最近的毒株ADV－Utah－1有著24個(gè)氨基酸的差別，再次說(shuō)明了阿留申病毒的氨基酸突變十分明顯。

盡管AD對(duì)水貂養(yǎng)殖業(yè)的危害巨大，但是目前國(guó)內(nèi)外還未研制出有效預(yù)防本病的疫苗，只能通過(guò)CIEP檢驗(yàn)血清淘汰病貂來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)本病的控制和根除［10］。筆者的研究分析表明，ADV的核苷酸和氨基酸的突變率都很高，國(guó)內(nèi)飼養(yǎng)水貂過(guò)程中ADV的基因在不斷突變，使用進(jìn)口抗原進(jìn)行AD檢測(cè)有可能會(huì)影響檢測(cè)的特異性和敏感性，使得出現(xiàn)假陰性的可能性增加，從而弱化了AD的凈化效果。

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