Lenzites gibbosa錳過氧化物酶1基因啟動子序列的克隆1)

吳書景 池玉杰 閆洪波

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

錳過氧化物酶(MnP;EC1.11.1.13)是一種依賴H2O2的含Fe3+的血紅素五聚體糖蛋白酶，同時也是一種常見的降解木質素的過氧化物酶，廣泛存在于白腐菌中，在真菌降解木質素的非特異性細胞外氧化還原酶中起著至關重要的作用。由于MnP對酚類和非酚類木質素和多環芳烴等多種異生物質都具有獨特的降解能力，它能夠有效地降解廢水和土壤中很難被降解的多氯聯苯、多環芳烴、DDT、染料、炸藥和其它氯化物等，因此這種酶在生物制漿、污水處理等生物技術應用中具有重要意義。Lenzittes gibbosa是東北地區常見的一種白腐菌，也是一種生長速度較快、對木材和木質素分解能力較強的白腐菌，筆者及其小組以前的研究表明這種白腐菌能夠產生錳過氧化物酶和漆酶［1］，并首先克隆到了該菌種的MnP基因［2］。筆者根據本研究小組已克隆到的L.gibbosa MnP1 cDNA全長基因Lg-mnp1，利用染色體步移法首先克隆到了Lg-mnp1上游的啟動子序列。對L.gibbosa MnP1基因Lg-mnp1啟動子的克隆有助于進一步深入研究mnp表達調控的關系，同時也為外源基因表達載體系統的構建提供了重要依據。

1 材料與方法

1.1 菌種來源與培養

白腐菌(Lenzittes gibbosa)菌株CB1采自長白山，自行分離得到，保存在東北林業大學森林保護學科森林病蟲病理實驗室。試驗前在PDA斜面培養基上培育的菌種冷藏于4℃冰箱。挑取小塊試管內的菌種，接種于PDA平板培養基上，于28℃下培養7 d。

1.2 基因組DNA的提取

取長勢較旺的一皿菌絲體，刮取新鮮菌絲，使用TIANGEN公司的 DNAquick_快捷型植物基因組DNA提取系統及相關方法提取真菌基因組DNA。將所得DNA取2 μL用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和大小，然后將DNA稀釋到終濃度為10～100 mg·L-1用于PCR反應。

1.3 Lg-mnp1啟動子區域擴增

根據已克隆到的L.gibbosa MnP1 cDNA全長基因Lg-mnp1，在 5'端設計了3個巢式特異性引物SP1、SP2和SP3，設計方向為需要擴增的未知區域方向，SP2在SP1的上游，SP3位于SP2的上游。其中，SP1:5'-CGCAGCGTTCGTAGTGGTCT-3';SP2:5'-GCGAGGAGAGAAACGAAGGAAG-3';SP3:5'-ATTGTCGTTGTCTGATGAGGGATG-3'。利用染色體步移技術(Genome Walking Kit試劑盒，TaKaRa)克隆其上游的啟動子序列。PCR的擴增體系、溫度條件和循環數見表1。擴增完畢后，取第二、三輪PCR反應液各2 μL，使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察電泳圖，確定目的條帶。使用Gel Extraction Kit(E.Z.N.A)試劑盒回收PCR產物的目的片段，再將DNA片段連接到 PMD20-T載體(TaKaRa)并轉化至Top10感受態細胞中，所得菌液交北京英駿公司測序。將測定的序列去除載體后，與Lg-mnp1編碼區原始序列進行拼接比對，確定為編碼區上游序列。采用 Signal Scan(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/signal/)對克隆到的Lg-mnp1啟動子序列進行分析［3-4］，確定其中的啟動子元件及核心區域。

2 結果與分析

2.1 L.gibbosa MnP1基因Lg-mnp1的啟動子序列與分析

篩選第2輪和第3輪PCR產物的目的片段，測序后得到1 568 bp的序列如圖1所示，與Lg-mnp1編碼區原始序列進行拼接比對，結果有90 bp的重疊，表明所得序列即為L.gibbosa MnP1基因Lgmnp1的啟動子序列。將該啟動子序列遞交Gen-Bank，登錄號為 HM369808。

表1 染色體步移PCR的擴增體系、溫度條件和循環數

圖1 L.gibbosa MnP1基因Lg-mnp1的啟動子序列

啟動子序列結構分析結果表明，Lg-mnp1 5'端上游包含了真核生物啟動子的基本轉錄調控元件，見表2及圖1。在起始密碼子上游-83 bp處有1個TATA-box，-119、-196 bp有 2 個反向 CCAAT-box(ATTGG)。-92～43 bp為Lg-mnp1啟動子的基礎啟動子區;在-52 bp處有一個轉錄起始位點。也存在多個順式作用元件，包括SP-1(GGGCGG)、激活子蛋白AP-2位點(CCCMNSSS)、熱激元件HSE(5'-NTTCNNGAAN-3')［5］及6個推定的金屬響應MREs(TGCRCNC)［6］等。

表2 Lg-mnp1啟動子包含的作用元件

2.2 白腐菌mnp基因啟動子元件的比較

將克隆到的白腐菌L.gibbosa MnP1基因Lgmnp1啟動子序列與前人研究的8種白腐菌16個mnp啟動子元件進行了比較，結果見圖2。從圖2可知，盡管Lg-mnp1的調控元件與其他記載的白腐菌mnp有很多相似之處，但元件分布、數目及方向都有所不同。有些菌株mnp啟動子不包含MRE(如Lentinula edodes［7］)，而有些菌株 mnp 啟動子存在正向的CCAAT-box。

3 結論與討論

本研究的白腐菌(Lenzites gibbosa)與偏腫栓菌(Trametes gibbosa)是同物異名，起初Persoon將其命名為偏腫迷孔菌(Daedalea gibbosa Pers.)，后來由Fries轉屬作為 Trametes gibbosa(Pers.ex Fr.)Fr.，該命名后來一直被沿用。1939年，日本京都帝國大學農學部植物病理學研究室的逸見武雄(Hemmi Takewo)曾根據其子實體的形態特征，將其重新轉屬命名為 Lenzites gibbosa(Pers.)Hemmi［19］，但并未被采用。Tom?ovsky等［20］對其進行系統發育分析后，發現其與Lenzites屬的系統學關系較近，遂認定Lenzites gibbosa為該種的合法名稱。由于該種已經轉屬到革裥菌屬，可將其中文名改為偏腫革裥菌，偏腫栓菌作為同物異名。

圖2 16個白腐菌mnp基因啟動子元件的比較

利用染色體步移法克隆了偏腫革裥菌Lg-mnp1啟動子序列，序列全長1 568 bp。經啟動子在線分析軟件分析可知，該5'端轉錄調控區序列包含了真核生物啟動子的基本轉錄調控元件:1個TATA-box和2個反向的CCAAT-box(ATTGG)，以及多個重要順式作用元件，包括轉錄因子SP-1、AP-2、熱誘導因子HSE、金屬響應因子MRE以及氮因子結合元件(GATA)等，這表明偏腫栓菌MnP在轉錄水平可能受氮源、錳以及熱休克調控，進一步的證據有待于對其5'端調控區域進行缺失分析研究。因此，對偏腫革裥菌Lg-mnp1啟動子的克隆，可為進一步揭示mnp表達調控的分子機制提供啟動子序列基礎。再者，在構建外源表達載體時，所應用的可以是質粒中的啟動子序列，也可以是自我基因的啟動子序列，這可根據試驗對比的結果篩選哪一個啟動子序列更有利于該基因的外源表達。因此，對偏腫革裥菌L.gibbosa的錳過氧化物酶基因啟動子序列的克隆，也為其外源基因表達載體系統的構建提供了基礎依據。

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