巴洛沙星–Tb3+–ATP熒光體系的建立及其分析應用

富波，陳傳燕，王磊

（1.山東大學藥學院，濟南 250012； 2.山東省高唐縣教育局，山東聊城 252000）

巴洛沙星–Tb3+–ATP熒光體系的建立及其分析應用

富波1，陳傳燕2，王磊1

（1.山東大學藥學院，濟南 250012； 2.山東省高唐縣教育局，山東聊城 252000）

在二元配合物巴洛沙星–Tb3+中加入ATP，Tb3+在其特征波長545 nm處的熒光強度增強，據此建立了新的巴洛沙星–Tb3+–ATP熒光體系。在最優化實驗條件下，增強的熒光強度與ATP的濃度呈良好的線性關系，線性范圍為2.0×10–6～3.0×10–5mol/L，檢出限為8.0×10–7mol/L。詳細的機理研究表明，ATP能與巴洛沙星–Tb3+形成大的三元絡合物熒光體系。新建立的熒光體系成功地應用于ATP注射液中ATP的定量檢測。對不同批次ATP注射液進行加標回收試驗，回收率為101%～106%，測定結果的相對標準偏差為1.1%～1.9%（n=5）。

ATP檢測；巴洛沙星；稀土鋱離子；喹諾酮類藥物

三磷酸腺苷二鈉（ATP）是三磷酸腺苷的二鈉鹽，分子式為C10H14N5Na2O13P3·3H2O，相對分子質量為605.19，化學名稱為腺嘌呤核苷-5'-三磷酸酯二鈉鹽三水合物。

作為一種輔酶，ATP參與機體內脂肪、蛋白質、糖、核酸以及核苷酸的代謝，同時ATP又是體內能量的主要來源，當機體吸收、分泌、肌肉收縮及進行生化合成反應等需要能量時，三磷酸腺苷即分解成二磷酸腺苷及磷酸基，同時釋放出能量。動物試驗證明，ATP可抑制慢反應纖維的慢鈣離子內流，阻滯或延緩房室結折返途徑中的前向傳導，大劑量時還可能阻斷或延緩旁路的前向和逆向傳導；另外ATP還具有短暫強的增強迷走神經的作用，因而能夠治療房室結折返和旁路折返機制引起的心律失常。

目前檢測ATP的方法主要有高效液相色譜方法［1，2］，生物發光法［3–6］和熒光分析法［7–10］。高效液相色譜方法準確度高，但是操作復雜而且靈敏度不高；生物發光法靈敏度較高，但是一般有復雜的生物化學反應，不容易控制；相比之下，熒光分析法不僅操作簡便，而且通常靈敏度較高，適用于常規分析測試。

目前已經建立的測定ATP的熒光分析法主要有銪–四環素類–ATP［7］和鋱–喹喏酮類–ATP［8，9］熒光探針法和共振光散射方法［10］。

巴洛沙星是第4代喹諾酮類抗菌藥，與其它喹諾酮類一樣，能夠與稀土鋱離子形成二元配合物，當將ATP加入到該二元體系中時，Tb3+在其特征波長545 nm處有明顯的熒光增強現象，并且增強的熒光強度與所加入的ATP的量之間呈良好的線性關系，據此建立了一種新的稀土發光方法來檢測ATP。該方法快速、簡單，而且線性范圍較寬，已經成功地用于ATP注射液樣品中ATP含量的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光分光光度計：F–4500型，日本日立公司；

紫外分光光度計：UV–2550型，日本島津公司；

酸度計：PHS–3C型，上海雷磁儀器廠；

熒光分光光度計：LS–55型，美國珀金–埃爾默公司；

巴洛沙星（BLFX）對照品：99.0%，山東羅欣藥業股份有限公司；

BLFX儲備液：1.0×10–3mol/L，精密稱取已干燥至恒重的巴洛沙星對照品0.038 9 g，滴入適量0.1 mol/L氫氧化鈉溶液使其溶解，定容至100 mL；

鋱離子（Tb3+）儲備液：1.0×10–2mol/L，精密稱取七氧化四鋱（Tb4O7，光譜純，進口分裝）0.187 1 g，滴加6 mol/L HCl適量，小心加熱使其溶解，待蒸發至近干，加水溶解并稀釋至100 mL，使用時逐級稀釋至刻度；

三磷酸腺苷二鈉（ATP）貯備液：1.0×10–2mol/L，精密稱取三磷酸腺苷二鈉(98%)0.061 7 g，加水溶解并稀釋至100 mL，使用時逐級稀釋至刻度；

Tris-HCl緩沖液：0.1 mol/L，精密稱取Tris 3.035 g，加水溶解并稀釋至250 mL，用6 mol/L HCl調節至pH 7.1；

NH4Cl–NH3緩沖液：0.1 mol/L，精密稱取NH4Cl 0.54 g，加水溶解并稀釋至100 mL，用NH3·H2O調節至pH 7.1；

NaAc–HAc緩沖液：0.1 mol/L，精密稱取NH4Cl 0.82 g，加水溶解并稀釋至100 mL，用HAc調節至pH 7.1；

NH4Ac–NH3緩沖液：0.1 mol/L，精密稱取NH4Cl 0.77 g，加水溶解并稀釋至100 mL，用NH3·H2O調節至pH 7.1；

所用試劑除標明含量外均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水，儲備液置于4℃的冰箱中保存。

1.2 實驗方法

于10 mL比色管中依次加入0.5 mL 0.1 mol/L Tris–HCl標準緩沖液，0.3 mL 1.0×10–4mol/L BLFX溶液，1.0 mL 1.0×10–3mol/L Tb3+溶液和不同體積1.0×10–4mol/L的ATP標準工作液，然后加蒸餾水稀釋并定容，振蕩搖勻，室溫下穩定10 min后測其熒光光譜和吸收光譜，用1.0 cm熒光池，分別在λex=296 nm，λem=545 nm的條件下測定熒光強度，激發和發射狹縫寬度均為10 nm。

2 結果與討論

2.1 激發光譜和發射光譜

在最佳實驗條件下，測定了該體系的激發和發射光譜，得到BLFX，ATP，BLFX–Tb3+，BLFX–ATP，Tb3+–ATP，BLFX–Tb3+–ATP的激發（1～6）和發射光譜（1’～6’）如圖1所示，IL代表熒光強度。

圖1 激發和發射光譜

從圖1中可以看出，單純的一元體系BLFX和BLFX–ATP二元體系的激發光譜相似，均在288 nm和334 nm處有一定的激發；一元體系ATP、二元體系BLFX–Tb3+和Tb3+–ATP沒有較明顯的激發峰，而三元體系BLFX–Tb3+–ATP分別在波長296 nm和335 nm有兩個明顯的激發峰。單純的BLFX在約450 nm處有一個很強的發射峰（圖中未完全顯示），BLFX–ATP也在約450 nm處有一個很強的發射峰，說明450 nm為BLFX的特征發射峰。BLFX–Tb3+二元體系在BLFX特征峰450 nm處的熒光明顯減弱，然而在Tb3+的特征發光波長545 nm處仍無明顯發光，當加入ATP于此二元體系形成BLFX–Tb3+–ATP三元體系時，發現在鋱離子的特征發射波長489 nm和545 nm較強的熒光發射峰，證明三元體系的形成有利于配體之間的能量轉移，使熒光量子產率大大提高。

分別以波長296 nm和335 nm為激發波長，測定了其發射光譜，結果表明當激發波長為296 nm時，三元體系BLFX–Tb3+–ATP在鋱離子的特征發射波長為489 nm和545 nm時有較強的熒光發射峰，當激發波長為335 nm時，三元體系BLFX–Tb3+–ATP在鋱離子的特征發射波長489，545，583 nm處均有較強的熒光發射峰。在鋱離子的特征發光波長545 nm處的強度以296 nm為激發波長時較強，因此選擇λex=296 nm，λem=545 nm進行進一步研究測定。

實驗條件：BLFX，3.0×10–6mol/L；Tb3+，1.0×10–4mol/L；ATP，3.0×10–5mol/L；Tris-HCl，5.0×10–3mol/L，pH 7.1。

2.2 pH值和緩沖溶液的影響

實驗優化了pH值的變化對體系熒光強度增強ΔIL（ΔIL=I–I0）的影響，其中I為BLFX–Tb3+–ATP的熒光強度，I0為BLFX–Tb3+體系即不加待測ATP的空白的熒光強度。同樣，以下其它條件均指對ΔIL的影響。pH值的影響如圖2所示，由圖2可知，當pH 7.1時，熒光強度ΔIL達到最大。同時實驗了pH 7.1的不同緩沖液的影響，包括Tris-HCl，NH4Cl–NH3，NaAc–HAc和NH4Ac–NH3等，結果如表1所示，發現Tris-HCl緩沖液的緩沖效果最好，實驗中選擇用0.5 mL 0.1 mol/L Tris–HCl緩沖液進行進一步研究。

圖2 pH的影響

表1 不同緩沖溶液對體系熒光強度的影響

2.3 巴洛沙星濃度的影響

在其它物質濃度均為最佳條件下，實驗了不同濃度的巴洛沙星（1.0×10–6～7.5×10–6mol/L）對體系熒光強度的影響，實驗發現當巴洛沙星的濃度在2.5×10–6～3.5×10–6mol/L范圍時體系的熒光強度增強達到最大，因此實驗中選擇最佳濃度3.0×10–6mol/L進行研究。

2.4 鋱離子濃度的影響

使體系中其它物質濃度都在最佳條件下且保持固定，實驗了不同濃度鋱離子對該體系的影響。實驗發現當鋱離子濃度為1.0×10–4mol/L時，體系的熒光強度增強達到最大且保持恒定，于是選擇1.0×10–4mol/L為最佳濃度進行研究。

2.5 試劑的加入順序和信號穩定性

在所有物質濃度均為最佳條件下，實驗了不同加樣順序對體系熒光強度的影響，結果如表2所示。實驗結果發現不同的加樣順序下體系的熒光強度差別不大，重復兩次實驗發現當加樣順序為BLFX，Tb3+，ATP，Tris–HCl時熒光強度最強。因此選擇此加樣順序進行下面的實驗。實驗了不同穩定時間對熒光強度的影響，結果發現當穩定10 min時熒光強度即可達到最大，繼續增加穩定時間熒光強度變化不大，信號強度在2 h內保持不變。

表2 試劑加入順序的影響

2.6 干擾物質的影響

固定ATP濃度為1.0×10–5mol/L，其它物質濃度均在最佳實驗條件下，實驗了一些共存物質的影響，結果如表3所示。結果發現相對誤差在±10%以內時，大多數氨基酸和金屬離子對體系熒光強度影響不大。

表3 共存干擾物質的影響

2.7 標準曲線和檢出限

在最優化實驗條件下，該體系的熒光強度ΔIL與ATP的濃度c呈良好的線性關系，線性范圍為2.0×10–6～3.0×10–5mol/L。線性方程為ΔIL=–161.4+9.391×107cATP，相關系數為0.998 1。在信噪比為3時，檢出限為8.0×10–7mol/L。

2.8 樣品分析

取市售ATP注射液針劑（江蘇康寶制藥有限公司，批號080753，080105，080454；天津藥業焦作有限公司，批號08072231），從針劑中精確量取1.0 mL于100 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，得到濃度為1.65×10–4mol/L的儲備液，使用時將其稀釋到一定程度即得工作液。

在10 mL比色管中，依次加入0.3 mL 1.0×10–4mol/L BLFX溶液，1.0 mL的1.0×10–3mol/L Tb3+溶液和0.6 mL 1.65×10–4mol/L的ATP注射劑工作液，0.5 mL 0.1 mol/L Tris–HCl標準緩沖液，按照實驗方法所述進行測定，測定結果如表4所示。結果顯示該方法測得的含量與標簽上的值在允許誤差范圍內能較好地符合。

表4 ATP注射液測定結果(n=5)

2.9 機理探討

2.9.1 BLFX–Tb3+–ATP三元復合物的形成

BLFX，ATP，BLFX–Tb3+，BLFX–ATP，Tb3+–ATP和BLFX–Tb3+–ATP的吸收光譜如圖3所示。

圖3 紫外吸收光譜

從圖3中可以看出，單純的BLFX在波長286 nm有一較強的吸收峰，在334 nm處有一個較弱但較平穩的吸收峰；BLFX–Tb3+與BLFX的吸收峰峰形相似，最大吸收波長略有紅移，分別在290 nm和336 nm處有兩個吸收鋒，且強度比BLFX有一定的增大，這說明BLFX和Tb3+存在相互作用，形成了配合物。單純的ATP僅在波長260 nm處有一個很強的吸收峰，在波長大于288 nm后無明顯吸收，說明ATP在260 nm處有特征吸收；BLFX–ATP除在259 nm處有一個很強的吸收峰，且強度大于單純的ATP外，在波長大于288 nm后約331 nm處有一較寬的吸收帶，但強度很弱；Tb3+–ATP在260 nm處有一個吸收峰，強度比單純的ATP稍低；三元體系BLFX–Tb3+–ATP不僅在ATP的特征吸收峰259 nm處有一吸收峰，而且在290 nm處出現了一肩峰，在334 nm處出現一較平穩峰，證明三者之間相互作用，又生成了新的BLFX–Tb3+–ATP大分子三元復合物。

通過共振光散射光譜（RLS）進行證明。按照實驗最佳條件配制溶液并穩定30 min后，用1.0 cm熒光池，通過同時掃描，使激發和發射波長相等，狹縫λex=10 nm/λem=10 nm，測定RLS光譜，共振光散射光譜如圖4所示。從圖4中可以看出，單純的一元體系BLFX的共振光散射很弱，單純的ATP的共振光散射較強，二元體系BLFX–Tb3+，BLFX–ATP，Tb3+–ATP的共振光散射強度沒有明顯增強，而三元體系BLFX–Tb3+–ATP的共振光散射有明顯的增強。證明了ATP與BLFX–Tb3+之間有強烈的相互作用，形成了一個大的超分子復合物。

圖4 共振光散射光譜

2.9.2 發光增強機制

喹喏酮類藥物BLFX是稀土鋱離子的良好配體，二者之間通過共振能量轉移，BLFX能將其能量轉移給稀土鋱離子，從而使鋱離子發出其特征熒光。加入ATP后，體系中發光明顯增強。通過以上實驗可知，BLFX和Tb3+的最佳條件下濃度比值為1∶33.3，即在該體系中Tb3+大大過量，則Tb3+除了與BLFX形成配合物外，還會和周圍的水分子結合，這樣就會因為水分子中O—H的震動而引起非輻射能量損耗。而加入ATP后，ATP中的三磷酸根負離子會與過量的鋱離子結合，從而取代了鋱離子周圍的水分子，形成了大的三元復合物BLFX–Tb3+–ATP，既減少了因水分子的O—H的震動而引起的非輻射能量損耗，又增加了體系的疏水性，所以體系中鋱離子的熒光明顯增強。

3 結論

在二元配合物BLFX–Tb3+中加入ATP，ATP能顯著增強該體系中鋱離子的特征發光，據此建立了一個新的BLFX–Tb3+–ATP熒光探針體系。詳細的機理研究表明ATP能與BLFX–Tb3+形成大的三元絡合物熒光體系。新建立的熒光探針體系成功地應用于ATP注射液中ATP的定量檢測，為常規檢測ATP提供了一個簡便靈敏的方法。

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Establishment of Balo fl oxacin-Tb3+–ATP Fluorescence System and Its Analytical Application

Fu Bo1， Chen Chuanyan2， Wang Lei1
（1.School of Pharmacy， Shandong University， Jinan 250012， China；2.Gaotang Education Bureau， Shandong Province， Liaocheng 252000， China）

A new balo fl oxacin-Tb3+–ATP fl uorescence system was established. Adding ATP into the binary system of balo fl oxacin-Tb3+，the fl uorescence intensity of Tb3+increased in its characteristic wavelength of 545 nm. Under the optimal experimental conditions，the enhanced fl uorescence intensity was proportional to the concentration of ATP in the range of 2.0×10–6–3.0×10–5mol/L，the detection limit was 8.0×10–7mol/L. The detailed mechanistic studies showed that ATP could form a ternary complex with balo fl oxacin-Tb3+. This new fl uorescence system was successfully applied to the quantitative detection of ATP in injection. The recoveries of ATP injecta were 101%–106%, the RSD was 1.1%–1.9%(n=5).

ATP detection; balo fl oxacin; terbium ion; quinolones

O657.39

A

1008–6145(2012)03–0039–05

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.011

聯系人：王磊；E-mail: wangl-sdu@sdu.edu.cn

2012–02–09