TBX2和PAX9在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義探討

張衛(wèi)東 李弘 江虹

甲狀腺癌是頭頸部的常見惡性腫瘤之一，其中甲狀腺乳頭狀癌（PTC）約占甲狀腺癌的60%～70%[1]。目前甲狀腺癌的發(fā)生機制尚不清楚，其發(fā)生、發(fā)展可能與眾多癌基因、抑癌基因有關(guān)。TBX2基因是T-BOX基因家族的成員之一， 參與多種生物的發(fā)育調(diào)控，屬于發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因。PAX9基因是PAX基因家族的新成員，是胚胎發(fā)育中不可或缺的調(diào)控基因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TBX2和PAX9在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[2-7]，但目前國內(nèi)外有關(guān)TBX2和PAX9在甲狀腺癌中的研究極少。本研究運用免疫組化和RT-PCR的方法檢測TBX2和PAX9在甲狀腺乳頭狀癌中的表達，并分析其與腫瘤臨床病理學(xué)意義，進而探討TBX2和PAX9在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2009年8月～2011年8月在某醫(yī)院乳腺外科手術(shù)切除的60例新鮮甲狀腺乳頭狀癌病例手術(shù)標(biāo)本及癌旁正常甲狀腺組織標(biāo)本20例。所有患者術(shù)前均未接受放、化療及其他免疫治療。將所取得的標(biāo)本分為兩部分，一部分置于中性福爾馬林內(nèi)固定以備行免疫組化檢查，另一部分迅速置液氮內(nèi)冷凍,-80℃低溫貯存,以備行RT-PCR。 60例患者（男14例，女46例），平均年齡(58.17±6.29)歲。經(jīng)術(shù)后病理檢查確診，TNM分期（2002年國際抗癌聯(lián)盟最新標(biāo)準(zhǔn)）：Ⅰ期8例，Ⅱ期28例，Ⅲ期20例，Ⅳ期4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性37例，陰性23例。

1.2 試驗方法

1.2.1 主要試劑 一抗兔抗人TBX2多克隆抗體、兔抗人PAX9多克隆抗體購于Santa Cruz公司，免疫組化染色超敏試劑盒(S-P法)和DAB顯色試劑盒均購自北京中山生物公司，Trizol試劑購自GIBOC公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組化SP法。所有標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋的組織制成5μm的連續(xù)切片，染色過程按試劑盒說明書進行，抗體稀釋至1：100，取已知陽性組織作陽性對照，PBS代一抗作陰性對照。二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。每張切片至少觀察5個視野,每個高倍視野至少觀察100個細胞。結(jié)果判定：由兩位高年資病理科醫(yī)生雙盲閱片，避開腫瘤壞死區(qū)域和邊緣區(qū)域。采用半定量分析法，陽性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：TBX2與PAX9以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。按陽性細胞百分比積分：（1）1分：0～25%；（2）2分：26%～50%；（3）3分：51%～75%；(4)4分：76%～100%。按染色強度的深淺積分：（1）0分：無染色；（2）1分：弱陽性（淺棕色）；（3）2分：強陽性（深棕色）。最后按陽性細胞百分比積分X染色強度的深淺積分計算最終積分：（1）積分1～2分為陰性；（2）3～8分為陽性。

1.2.3 半定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）采取Trizol試劑提取甲狀腺乳頭狀癌組織及正常甲狀腺組織，經(jīng)紫外分光光度計檢測OD260、OD280，純RNA樣本OD260／OD280比值為1.8～2.0，低于此值表示存在蛋白質(zhì)污染，1%瓊脂糖凝膠電泳示5S、18S和28S清晰RNA熒光條帶，說明RNA完整無降解。引物設(shè)計：TBX2：上游序列：5′CACTCGCTTGACCGAACCC 3′，下游序列：5′CGCACTGTCTGTCTGCACCA 3′，預(yù)擴增片斷為211Bp；PAX9：上游序列：5′TGCTGGACATGGGTGGCA 3′，下游序列：5′AGGCAGAAGGGTTGGAGGG 3′，預(yù)擴增片斷為246Bp；GAPDH：上游序列：5′GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT 3′,下游序列：5′AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC 3′，預(yù)擴增片斷為616Bp。經(jīng)過94℃變性1min，56℃退火40s，72℃延伸30s，30個循環(huán)后，72℃再延伸10min。電泳成像系統(tǒng)掃描分析，計算GRP78mRNA的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗和t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果顯示（如圖1），60例甲狀腺乳頭狀癌組織中46例TBX2蛋白表達陽性，14例表達陰性，陽性率76.67%；20例正常甲狀腺組織中，4例TBX2蛋白表達陽性，16例表達陰性，陽性率為20.00%；TBX2蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中陽性表達明顯高于正常甲狀腺組織，兩者存在差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

免疫組化染色結(jié)果顯示（如圖2），60例甲狀腺乳頭狀癌組織中48例PAX9蛋白表達陽性，12例表達陰性，陽性率80.00%；20例正常甲狀腺組織中，5例PAX9蛋白表達陽性，15例表達陰性，陽性率為25.00%；PAX9蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中陽性表達明顯高于正常甲狀腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）結(jié)果 根據(jù)RTPCR結(jié)果顯示（如圖3～4），甲狀腺乳頭狀癌組織中TBX2 mRNA及PAX9 mRNA的相對表達水平明顯高于正常甲狀腺組織組織，甲狀腺乳頭狀癌組織中TBX2 mRNA為（1.17±0.24）,正常甲狀腺組織組織為（0.12±0.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。甲狀腺乳頭狀癌組織中PAX9 mRNA為（1.09±0.19）,正常甲狀腺組織組織為（0.17±0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

圖1 TBX2在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達（SP×200）

圖2 PAX9在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達（SP×200）

圖3 TBX2 mRNA的表達

圖4 PAX9 mRNA的表達

2.3 TBX2和PAX9的表達與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征的關(guān)系 甲狀腺乳頭狀癌組織TBX2和PAX9的蛋白及mRNA表達均與TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、性別無關(guān)（P≥0.05），見表1～2。

2.4 TBX2蛋白和PAX9蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析顯示，TBX2蛋白和PAX9蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.471，P＜0.05）。

3 討論

TBX2基因是發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，屬于轉(zhuǎn)錄因子T-box家族成員之一，其通過特有的T-box區(qū)域參與多種生物的發(fā)育調(diào)控，是T-box基因家族成員中僅有的兩個轉(zhuǎn)錄抑制基因之一。TBX2在各種組織和器官的胚胎發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TBX2在多種腫瘤中高表達，并且與細胞的凋亡、惡性轉(zhuǎn)化及細胞增殖有著密切關(guān)系[2，6]。本研究發(fā)現(xiàn)，TBX2在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達明顯高于正常甲狀腺組織，并且隨著甲狀腺乳頭狀癌臨床分期的增加、分化程度的降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TBX2的表達明顯增加，說明TBX2在促進甲狀腺乳頭狀癌進一步演變惡化中起著重要的作用。

表1 TBX2蛋白和PAX9蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征的關(guān)系

表2 TBX2 mRNA和PAX9 mRNA表達與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表2 TBX2 mRNA和PAX9 mRNA表達與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s）

臨床特征 例數(shù) TBX2 mRNA P值 PAX9 mRNA P值組織 ＜0.01 ＜0.01乳頭狀癌 60 1.17±0.24 1.09±0.19正常 20 0.12±0.03 0.17±0.05年齡 ＞0.05 ＞0.05＜45歲 40 1.16±0.11 1.08±0.20≥45歲 20 1.18±0.07 1.10±0.09性別 ＞0.05 ＞0.05男15 1.16±0.15 1.09±0.12女45 1.17±0.09 1.09±0.21 TNM分期 ＜0.01 ＜0.01Ⅰ～Ⅱ期 36 0.89±0.10 0.71±0.14Ⅲ～Ⅳ期 24 1.31±0.21 1.27±0.21淋巴轉(zhuǎn)移 ＜0.01 ＜0.01有37 1.41±0.19 1.31±0.19無23 0.91±0.16 0.80±0.11分化程度 ＜0.01 ＜0.01高、中 39 0.84±0.17 0.81±0.24低21 1.43±0.20 1.29±0.29

PAX9基因是PAX家族新發(fā)現(xiàn)成員，廣泛參與了腦、胸腺、甲狀旁腺等器官的胚胎發(fā)育，是胚胎發(fā)育中不可缺少的調(diào)控基因。目前有關(guān)PAX9基因的研究主要集中在其與牙齒發(fā)生、分化的關(guān)系方面[8]，僅有少量有關(guān)PAX9基因在肺癌、食管癌及口腔鱗狀細胞癌等方面的研究[3-5]，尚未有PAX9在甲狀腺癌方面的報道。本研究證實PAX9在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達明顯高于正常甲狀腺組織，并且其表達與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。

已有研究表明TBX2可以使p53表達水平下降從而降低caspase-3的生物學(xué)活性，促進細胞凋亡的發(fā)生[9]。PAX9能夠在轉(zhuǎn)錄水平上降低caspase-3的表達，促進腫瘤的發(fā)生及進展[5，10]。研究中筆者還發(fā)現(xiàn)，TBX2蛋白和PAX9蛋白表達呈正相關(guān)，說明TBX2和PAX9在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生及進展中可能起著協(xié)同作用，可能共同通過對caspase-3的表達的影響共同促進腫瘤的生物學(xué)行為。

綜上所述，TBX2和PAX9在甲狀腺乳頭狀癌中的表達明顯增強，并且與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，TBX2和PAX9有望成為甲狀腺乳頭狀癌新的生物學(xué)標(biāo)記和腫瘤基因治療的新的靶點，為甲狀腺癌的診療提供新的方向。

[1]Singh N,Rogers P,Atwood CW,et al.Short-course empiric antib iotic therapy for patients with pulmonary infiltrates in the intensiv e cane unit[J].Am J Respir Crit Care Med,2000,162(2)：505-511.

[2]Teng H,Parker M I,Prince S.Functional characterization of cisactingelements involved in basal transcription of the human TBX2 gene：a new insightinto the role of Sp1 in transcriptional regul ation[J].Gene,2008,423(1)：8-13.

[3]Harris T,Pan Q,Sironi J,et al.Both gene amplification and allelic loss occur at 14q13.3 in lung cancer[J].Clin Cancer Res,2011,17(4)：690-699.

[4]Kendall J,Liu Q,Bakleh A,et al.Oncogenic cooperation and coamplification of developmental transcription factor genes in lungCancer[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(42)：16663-16668.

[5]Lee J C,Sharma M,Lee Y H,et al.PAX9 mediated cell survival in oral squamous carcinoma cell enhanced by c-myb[J].Cell Bioch em Funct,2008,26(8)：892-899.

[6]Liu W K,Jiang X Y,Zhang Z X.Expression of PSCA,PIWIL1,and TBX2 inendometrial adenocarcinoma[J].Onkologie,2010,33(5)：241-245.

[7]苗雷英，李祥偉，劉超，等.涎腺腫瘤中PAX9基因的表達及意義[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2006，22(1)：8-11.

[8]趙計林，陳揚熙，鮑朗，等.中國先天性缺牙患者PAX9基因的新突變[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，40(4)：266-269.

[9]Dobrzycka K M,Kang K,Jiang S,et al.Disruption of scaffold attachment factor B1 leads to TBX2 up-regulation,lack of p19ARF induction,lack of senescence,and cell immortalization[J].Cancer Res,2006,66(16)：7859-7863.

[10]Seoane J,Le H V,MassaguéJ.Myc suppression of the p21(Cip1)Cdk inhibitor influences the outcome of the p53 response to DNA damage[J].Nature,2002,419(6908)：729-734.