環介導等溫擴增技術在小兒下呼吸道肺炎嗜衣原體感染中的應用

潘德鋒 佘菊香 胡春艷

環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種敏感、特異、方便快捷的核酸擴增技術。因其無需特殊設備，且具有PCR類似的靈敏度和特異性，目前日益受到臨床重視[1]。肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae,Cpn）是一種能引起非典型性肺炎的嚴格細胞內寄生的病原體，能導致10%小兒社區獲得性肺炎[2-3]。由于Cpn分離培養困難，臨床誤診較多。本研究通過對比LAMP和最常用的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）在檢測小兒Cpn下呼吸道感染情況，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究所納入的研究對象為2010年1月～2012年1月我科收治的80例下呼吸道感染患兒，其中，男性患兒42例，女性患兒38例。年齡2.5～8.5歲，平均年齡（5±0.5）歲。所有患兒均有不同程度的呼吸道感染臨床癥狀，并排除其他肺外感染性疾病。

1.2 Cpn IgM抗體檢測 入院當日空腹抽取靜脈血2mL，抗凝后于1000r離心10min，取200μ L血清用于IgM抗體檢測。方法按照德國EuroImmun ELISA試劑盒提供的操作進行。根據酶標儀測定的最OD值（λ=450nm）計算IgM的滴度。

1.3 LAMP實驗 根據GenBank提供的Cpn基因序列設計兩條外引物、兩條內引物和兩條環結合引物（因涉及專利問題，序列無法列出）。反應體系包括1μL上述3種引物，1.5μL 20×buffer，2.5μLMgCl2，1.25μLdNTP（10mmol/L），5μ L 5×Betaine，Bst多聚酶0.5μL，模板0.5μL，RNA酶0.5μL。反應條件為65℃ 45min，結束后用2%瓊脂糖凝膠電泳，若出現LAMP特征性梯狀條帶者為陽性。

1.4 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件對數據進行統計學處理，計數資料組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準：α=0.05，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 患兒下呼吸道Cpn檢出情況 80例患兒分別采用ELISA和LAMP法對Cpn IgM或DNA進行檢測，從表1可以看出，ELISA法可檢測出47例陽性，陽性率為58.8%，而LAMP法Cpn陽性患者為57例，陽性率為71.3%，經統計學分析，P＞0.05。

表1 ELISA與LAMP對Cpn的檢出情況比較

2.2 服用抗生素對ELISA和LAMP檢測Cpn的影響 80例患兒在進入我院治療前，有49例曾有抗生素服用史，這些患兒分別經ELISA和LAMP檢測，結果顯示患兒當中，ELISA法檢測出26例IgM陽性（53.1%），而LAMP的檢出率達75.5%（37/49），經統計學分析，P＜0.05，見表2。

表2 ELISA與LAMP對已服用抗生素患兒Cpn的檢出影響

3 討論

Cpn是一類嚴格細胞內寄生的病原體，也是公認最難分離培養的微生物之一，除了血清學診斷，目前尚無其他靈敏、簡便又易于推廣的方法。直接免疫熒光檢測脫落細胞中的抗原或者采用微量免疫熒光法檢測血清中的抗體一向被認為是診斷Cpn感染的“金標準”。但對于嬰幼兒來說，此方法實際可行性較小。

本實驗通過LAMP技術建立的Cpn檢測方法，它能在等溫條件下高效地擴增DNA，與PCR相比，LAMP受到無關DNA的影響較小[4]。在一個周期為45min的LAMP反應體系中，Cpn只需要達到6個拷貝的濃度就可被LAMP檢出。此外，由于LAMP是在等溫條件下持續進行的擴增反應，因此溫度變化導致的損耗較小，這決定了LAMP效率高的特性。通常情況下，LAMP可在60min內將目的基因擴增109倍以上。本研究結果顯示，和目前臨床常用的ELISA相比，LAMP具有較高的檢出率。但本研究顯示兩者并無統計學意義，因此在后續研究當中還需要進一步增加樣本含量加以分析。

在本研究所納入的患兒當中，有49位患兒入院前曾服用過大環內酯類等抗生素治療。而對于這些患者，ELISA僅檢測出26例陽性，而LAMP可檢測出37例，兩者比較具有統計學差異。這表明ELISA法與LAMP法相比，雖然總體上對Cpn的檢出率并無統計學差異，但對于已使用過抗生素的患兒來說，LAMP顯示出了較好的敏感性。

綜上所述，本研究采用LAMP檢測小兒下呼吸道Cpn感染，由于其操作簡單、模板需求量少等優點，有望成為核酸擴增的重要方法。隨著LAMP技術的不斷完善和改進，LAMP技術將在病原體診斷方面有更廣闊的發展前景。

[1]Zhou S,Han S,Shi J,et al.Loop-mediated isothermal amplification for detection of porcine circovirus type 2[J].Virol J,2011,8：497.

[2]曾賽麗,游曉星,劉良專,等.衣原體肺炎患者支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6及IL-10的檢測及臨床意義[J].當代醫學,2011,17(34)：15-16.

[3]張荔茗,張英,周細國.急性毛細支氣管炎兒童非典型細菌感染分析[J].當代醫學,2012,18(14)：3-4.

[4]Suwanampai T,Pattaragulvanit K,Pattanamahakul P,et al.Evaluation of loop-mediated isothermal amplification method for detecting enterotoxin A gene of Staphylococcus aureus in pork[J]. Southeast Asian J Trop Med Public Health,2011,42(6)：1489-1497.