肝癌細胞疫苗對荷瘤小鼠脾淋巴細胞IFN－γ生成及腫瘤浸潤淋巴細胞的影響＊

蘇 立，周 顰，李正芳，傅 敏，白 平，劉 楠，王智彪

（1.重慶市中醫院腫瘤科 400011；2.重慶市中醫院內分泌科 400011；3.重慶醫科大學醫學超聲工程研究所 400016）

研究發現高強度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）輻照腫瘤細胞制備的腫瘤疫苗（簡稱瘤苗）可使免疫小鼠獲得一定的抗同源腫瘤的免疫力［1］，但瘤苗誘導的動物體內免疫功能的變化尚不清楚。T淋巴細胞介導的細胞免疫是抗腫瘤免疫反應的主體，體內某些細胞因子的增多是細胞免疫活化的標志，而淋巴細胞在腫瘤中的浸潤程度通常被認為與腫瘤宿主的預后相關［2－3］。本實驗以H22荷瘤小鼠為模型，在觀察HIFU瘤苗免疫小鼠大體抗腫瘤效應的基礎上，探討免疫后的荷瘤小鼠脾淋巴細胞干擾素－γ（IFN－γ）生成以及腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）的變化，以了解HIFU瘤苗免疫對小鼠免疫功能的影響。同時以高溫凝固方法制備的瘤苗作對照，比較HIFU瘤苗效能。

1 材料與方法

1.1材料 HIFU腫瘤治療系統由重慶醫科大學超聲工程研究所提供；雌性BALB/c小鼠共108只，6～8周齡，體質量18～22g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供；H22小鼠肝癌細胞株由重慶醫科大學實驗細胞庫提供；兔抗小鼠CD4及兔抗小鼠CD8抗體購自北京博奧森公司，免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒及小鼠IFN－γELISA試劑盒購自北京中杉金橋公司；ELX800酶標儀購自美國Bio－Tek公司。

1.2方法

1.2.1制備HIFU和高溫瘤苗 將H22細胞調整濃度為1×107/mL，HIFU輻照該細胞懸液制成HIFU瘤苗，HIFU參數為：聲強1 054W/cm2、焦距110mm、頻率0.8mHz、時間80s。另取相同的細胞懸液65℃高溫水浴1h制備高溫瘤苗。

1.2.2小鼠腫瘤體積測量 將60只小鼠，隨機分為3組，每組20只，每組分別接受HIFU瘤苗、高溫瘤苗及生理鹽水皮下注射，每只0.2mL，每周1次，連續4周，第5周以對數生長期的H22細胞4×106個/只小鼠腋前皮下注射。接種后游標卡尺每周測量小鼠瘤體長徑（a）與橫徑（b），以（a×b2）/2計算腫瘤體積［4］。

1.2.3小鼠脾淋巴細胞IFN－γ生成水平檢測 小鼠18只，分3組，每組6只，每組分別接受HIFU瘤苗、高溫瘤苗、生理鹽水皮下注射及再接種H22細胞同前，接種H22細胞后1周處死，無菌取脾，于金屬篩網上剪碎研磨，收集勻漿以小鼠淋巴細胞分離液梯度離心，獲得脾淋巴細胞懸液。取此淋巴細胞2×104個與H22細胞2×103個混合加入96孔板，在含10%FBS的RPMI1640中共育48h，每組設3個復孔，之后1 500r/min離心10min，取上清液用ELISA法測IFN－γ。ELISA按試劑盒說明步驟進行，以酶標儀測492nm波長處吸光值。

1.2.4免疫組化 將30只小鼠，分3組，每組10只，按同樣方法分別免疫并接種，接種H22細胞2周后處死小鼠，切取其皮下腫瘤，4%中性多聚甲醛固定、常規脫水、石蠟包埋，5μm切片。免疫組化按照試劑盒說明書進行。

1.2.5TIL半定量分析 鏡下細胞膜或細胞質顯現棕黃色判定為CD4＋或CD8＋細胞。陽性細胞半定量分析參考文獻［2－3］方法：每個標本鏡下隨機選取10個高倍視野（×200），以腫瘤內部陽性細胞分布最豐富的3個視野作為計數范圍。根據視野內平均陽性細胞數（1～＜20、20～＜50、≥50），將細胞浸潤程度分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個等級。計數時排除腫瘤邊緣及壞死區域。

1.3統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，腫瘤體積數據用析因方差分析，腫瘤淋巴細胞浸潤結果行Mann－Whiney U秩和檢驗，其他數據行單因素方差分析，計量數據結果以s表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組小鼠腫瘤體積和生存期比較 因生理鹽水組小鼠在接種H22細胞21d后出現較多死亡，故記錄21d內各組的腫瘤體積。21d內生理鹽水組小鼠死亡2只，按死亡時腫瘤體積記錄，結果顯示各組小鼠間腫瘤體積有差異，21d時生理鹽水組腫瘤體積為（3 509±524）mm3，高溫瘤苗組為（2 001±472）mm3，HIFU瘤苗組為（1 601±383）mm3（P＜0.05），見圖1。觀察生存情況至6周，各組小鼠生存期存在明顯差異，平均生存期生理鹽水組為（23.3±1.0）d、高溫瘤苗組為（31.8±0.9）d，HIFU瘤苗組為（35.7±1.1）d（P＜0.05），見圖2。

圖1 接種H22細胞21d內各組小鼠的腫瘤體積比較

2.2小鼠脾淋巴細胞分泌IFN－γ水平 各組小鼠免疫后在H22細胞的再刺激下，其脾淋巴細胞IFN－γ分泌水平為：生理鹽水組（1 133±208）pg/mL，高溫瘤苗組（6 333±351）pg/mL，HIFU瘤苗組（9 366±1 026）pg/mL，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3瘤苗對各組小鼠TIL的影響 兩種瘤苗免疫的荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4＋、CD8＋細胞浸潤均較明顯。根據陽性細胞浸潤分級計算，高溫瘤苗及HIFU瘤苗組腫瘤組織內CD4＋、CD8＋細胞浸潤程度較生理鹽水組有顯著提高（P＜0.05），兩種瘤苗組間TIL浸潤程度差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

圖2 接種H22細胞后各組小鼠的生存曲線

表1 各組小鼠腫瘤淋巴細胞浸潤程度的分布（n＝10）

3 討 論

腫瘤疫苗作為腫瘤免疫治療的重要部分被廣泛研究，其種類較多，包括腫瘤細胞疫苗、樹突狀細胞疫苗、腫瘤肽類疫苗及腫瘤DNA疫苗等［5］，又可依據針對腫瘤抗原的不同分為全腫瘤細胞即多表位疫苗和特定抗原表位疫苗。全腫瘤細胞疫苗攜帶了完整的腫瘤抗原庫，無需篩選腫瘤特異性抗原，這是全腫瘤細胞疫苗相對特定抗原疫苗的優勢。目前滅活腫瘤細胞已獲得全腫瘤細胞疫苗的方法有：反復凍融、熱凝固、放射輻照、紫外線照射、甲醛固定及光動力殺傷等，但有的方法效果并不理想［6］，本研究以HIFU輻照腫瘤細胞制備疫苗，為研制腫瘤疫苗提供了一種新方法，HIFU瘤苗免疫小鼠后大體觀察發現腫瘤生長受抑制，小鼠生存期延長，提示HIFU瘤苗具有提高實驗動物抗腫瘤免疫力的效果。

抗腫瘤免疫的主體是細胞免疫，由1型輔助性T細胞（Th1）介導，而2型輔助性T細胞（Th2）介導免疫應答向體液免疫發展。Th1細胞產生的細胞因子主要是IFN－γ、IL－2，而Th2細胞主要分泌IL－4、IL－5。Th1類和Th2類細胞因子的平衡決定了哪種免疫反應占主導地位，Th細胞由分泌Th1類細胞因子向Th2類因子轉換可能是抗腫瘤免疫失效的機制之一［7］。IFN－γ也可由活化的CD8＋細胞分泌，主要是細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）分泌，故IFN－γ水平增高可以作為是細胞免疫增強和CTL活化的標志，這對抗腫瘤是有益的。本實驗發現經HIFU瘤苗免疫，荷瘤小鼠脾淋巴細胞在同源腫瘤再刺激下IFN－γ生成較未免疫小鼠成倍增加，提示經瘤苗免疫小鼠體內產生了對該腫瘤敏感的淋巴細胞群，也表明細胞免疫的增強及CTL細胞激活。

免疫組化結果顯示兩種瘤苗免疫后小鼠TIL數量較未免疫組有顯著提高。文獻報道TIL數量是有利于宿主的預后因子，如CD4＋和CD8＋細胞浸潤較多的食管鱗癌患者有較長的生存期［3］，而CD3＋細胞在腫瘤周邊浸潤較少是宮頸癌復發的高危因素［8］。有研究表明腫瘤實質中的TIL數量比腫瘤間質或邊緣的TIL數量和預后的關系更加確切［9］，本實驗中以腫瘤實質內的TIL為觀察對象，發現瘤苗組腫瘤浸潤CD4＋和CD8＋細胞較未免疫組增多，這與觀察到的免疫小鼠腫瘤生長受抑制是吻合的。腫瘤生長抑制和動物生存期延長在HIFU瘤苗組較高溫瘤苗組更加明顯，但兩種瘤苗組間TIL浸潤程度無顯著差異，其原因可能在于除TIL的數量外，宿主預后與TIL之間還存在其他的影響因素［10］，如TIL的具體類型被認為是另一重要的預后因素，CD4＋輔助細胞被認為對誘導CTL產生及維持CTL記憶有明確作用，而CD4＋細胞中的調節T細胞（Treg）亞群，則可能下調抗腫瘤免疫反應［7］。本實驗中未能區分CD4＋細胞的具體亞群，另外由于本實驗中樣本數較少且免疫組化及半定量的方法檢驗效能有限，可能未顯示出兩組潛在的差別。

為了衡量HIFU瘤苗的效能本研究以熱凝固方法制備高溫瘤苗作對照，理論上二者同屬全腫瘤細胞疫苗，包含了相同的腫瘤抗原，且在本實驗參數條件下HIFU輻照對細胞也產生65℃左右的熱效應，但實驗結果顯示HIFU瘤苗效能優于高溫瘤苗，其機制并不清楚，這可能與HIFU輻照對細胞產生的特殊的生物學效應有關，HIFU輻照除產生熱效應外，還對細胞形成特有的機械效應及空化效應。近來研究認為細胞死亡時的某些物質釋放能激活免疫，這是一些被稱作“危險信號”或“損傷相關分子形式”的物質，如：熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）、核苷酸、鈣網蛋白等［11－13］。研究顯示 HIFU 的機械和空化效應比HIFU的熱效應更有利于輻照細胞“危險信號”的釋放［14］，而HIFU的輻照也促使細胞釋放“損傷相關分子形式”之一的HSP［15］，這可能是HIFU輻照瘤苗比單純熱凝固細胞瘤苗免疫效能更高的原因之一。

綜上所述，HIFU制備瘤苗的免疫能明顯抑制同源移植腫瘤在動物體內的生長，延長實驗動物的生存期。腫瘤刺激下HIFU瘤苗免疫動物的脾淋巴細胞IFN－γ生成增高，提示機體細胞免疫被激活。腫瘤生長受抑制可能與增多的淋巴細胞浸潤有關。

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