多菌靈高效降解菌的篩選與降解特性分析1)

李明石 曲 迪 李成龍 王呈玉 王玉軍 趙蘭坡

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

多菌靈(Carbendazim)是一種廣譜型內(nèi)吸性、環(huán)境激素類化學(xué)農(nóng)藥［1］，化學(xué)名稱 N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯。許多國家用于農(nóng)業(yè)上防治各種作物病害［2］，其它內(nèi)吸性殺菌劑如苯菌靈、苯并咪唑類和托布津類殺菌劑均可在土壤中和作物體中轉(zhuǎn)化為多菌靈而起到藥效作用［3］。多菌靈在土壤和水體中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期較長，長期施用多菌靈對土壤和水體造成污染，同時(shí)可以在水果蔬菜等作物中殘留，對哺乳動物易導(dǎo)致免疫功能下降和染色體畸變而影響后代繁衍［4-9］。

近年來，隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展，在設(shè)施蔬菜生產(chǎn)過程中，大量的使用有機(jī)合成農(nóng)藥——多菌靈，導(dǎo)致多菌靈在設(shè)施土壤中有一定的累積，造成了土壤和地下水污染加劇，這不僅影響到設(shè)施蔬菜的高產(chǎn)、高效及優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)，而且影響蔬菜的質(zhì)量安全，成為設(shè)施蔬菜可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵制約因素［10］。多菌靈污染場地的生物修復(fù)作為多菌靈污染治理的一種易于實(shí)現(xiàn)原位修復(fù)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保又有效的重要方法，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。分離篩選高效降解菌是多菌靈污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)中需要解決的關(guān)鍵問題，成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)針對設(shè)施蔬菜土壤多菌靈污染比較嚴(yán)重的特點(diǎn)，通過低溫條件下富集篩選，從長期施用多菌靈的設(shè)施蔬菜土壤中分離到一株高效降解菌Enterobacter sp.D5，并對其降解特性進(jìn)行分析，以期為多菌靈污染設(shè)施蔬菜土壤及水體的生物修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)材料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤和藥劑:供試土壤采自吉林省撫松市某長期施用多菌靈的土壤(0～30 cm);多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品(有效成分含量≥98%)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院農(nóng)藥教研室提供;甲醇(色譜純)、三氯甲烷(色譜純)、丙酮(色譜純)、鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)。

儀器:Eppendorf 5810R低溫高速離心機(jī)(德國艾本德公司)、GA92-II2DB細(xì)胞超聲破碎儀(無錫上佳生物科技有限公司)、UV1200型紫外可見分光光度、1100液相色譜儀(美國Agilent公司)、BS224S電子天平、HZ-9211K恒溫振蕩器。

無機(jī)鹽培養(yǎng)液:Na2HPO4· 2H2O 8.5 g，KH2PO43.0 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl214.7 mg，CuSO40.4 mg，KI 1.0 mg，MnSO4· H2O 4.0 mg，ZnSO4· 7H2O 4.0 mg，H3BO35.0 mg，H2MoO4·2H2O 1.6 mg，F(xiàn)eCl3·6H2O 2.0 mg，蒸餾水1 000 mL。pH 值7.0 ～7.2、121.3 ℃滅菌25 min。

富集培養(yǎng)基:無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中加入需要量的多菌靈。

分離培養(yǎng)基:無機(jī)鹽培養(yǎng)液，多菌靈15 g，瓊脂18 g。pH 值7.0 ～7.2、121.3 ℃滅菌25 min。

LB培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，瓊脂18 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多菌靈高效降解菌的富集篩選

將10 g土樣加入到100 mL以多菌靈為唯一碳源的富集培養(yǎng)基中，15℃，200 r·min-1搖床培養(yǎng)5 d，取富集的菌懸液10 mL，加入到新鮮的富集培養(yǎng)基中，在相同條件下富集培養(yǎng)5 d，連續(xù)富集傳代5次，使多菌靈質(zhì)量濃度依次為 20、40、60、80、100 mg·L-1。經(jīng)鑒定能降解多菌靈達(dá)90%以上的富集液為有活性的富集液。將活性富集液進(jìn)行梯度稀釋涂布LB平板。挑取單菌接種液體富集培養(yǎng)基，通過HPLC分析驗(yàn)證其降解能力。

1.2.2 多菌靈降解菌的鑒定

對分離純化得到的菌株進(jìn)行菌體形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)。同時(shí)將獲得的菌株接入LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收獲菌體，提取菌株RNA。以細(xì)菌16 S rRNA通用引物27 f和1 492 r對該菌株基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件:95℃ 5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30 個(gè)循環(huán);72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，用Clustal W對測序結(jié)果與GenBank中相關(guān)的16 S rRNA序列進(jìn)行比對，通過MEGA4.0軟件對菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用Bootstrap法(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)。

1.2.3 菌株對多菌靈降解的最佳條件

降解試驗(yàn)基本條件為:在100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，以100 mg·L-1多菌靈為唯一碳源，接種量 OD600nm=0.2、20 ℃、pH 值 7.0、200 r·min-1;最佳條件降解試驗(yàn):通過分別改變降解基本條件中的初始 pH 值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和 10.0)、溫度(5、10、15、20、25、30 和 35 ℃)、多菌靈添加量(50、100、150、200 和 250 mg·L-1)，在其他條件保持不變的情況下，培養(yǎng)12 d，進(jìn)行單因素條件試驗(yàn)。各單因素設(shè)計(jì)以不接種和滅活菌為對照，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，測定菌株對多菌靈農(nóng)藥的降解量。

1.2.4 最優(yōu)條件下菌株生長量和多菌靈降解曲線的測定

將菌株置于100 mL含100 mg·L-1多菌靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于 20 ℃、pH 值 7.0、200 r·min-1搖床培養(yǎng)，分別在 2、4、6、8、10、12 d 測定菌株對多菌靈農(nóng)藥的降解量，同時(shí)測定菌株OD600nm生長量，分析菌株生長量與降解量之間的關(guān)系。

1.2.5 多菌靈的HPLC檢測方法

三波長校正法［11］:配置5 g·L-1(有效成分)的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，按需稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度。稱取100 μL樣品，用稀鹽酸(1+11)定容至 10 mL，分別測定其在278、280和290 nm波長處的吸光度，由ΔA=A280-(A278+A290)/2計(jì)算出校正吸光度ΔA，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的多菌靈含量進(jìn)行定量分析。

100 mL培養(yǎng)液中加入250 mL三氯甲烷震蕩萃取30 min倒入分液漏斗中，再用250 mL三氯甲烷清洗培養(yǎng)瓶后全部倒入分液漏斗中震蕩萃取，在10 mL的比色管中加入2 mL萃取液，于60℃恒溫水浴中至三氯甲烷完全揮發(fā)，用10 mL甲醇定容，待測。色譜柱:C18 柱，25 cm×4.16 mm;柱溫為30 ℃;流動相為V(甲醇)∶V(水)=70∶30;流速為0.8 mL·min-1;檢測波長為280 nm;進(jìn)樣體積為20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌靈降解菌的篩選和鑒定

以多菌靈為唯一碳源，經(jīng)過50 d的富集篩選，得到1株多菌靈高效降解菌D5。該菌短桿狀，革蘭氏染色陰性、無芽胞;純培養(yǎng)菌落為乳黃色且略透明;其能利用葡萄糖產(chǎn)氣，V.P.反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、吲哚實(shí)驗(yàn)、氧化酶、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)、苯丙氨酸脫氫酶、精氨酸雙水解酶及明膠液化反應(yīng)陰性。應(yīng)用細(xì)菌16 S rDNA通用引物27 f和1492 r有效擴(kuò)增出1265 bp的片段，將測序結(jié)果在GenBank中利用Blast軟件進(jìn)行同源性序列比對，以大腸桿菌為外源構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。

圖1 根據(jù)16 S rRNA部分基因序列構(gòu)建的菌株D5與相關(guān)種屬的系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株D5與已報(bào)道的Enterobacter屬細(xì)菌親緣關(guān)系最近，與Blast結(jié)果一致。因此，菌株D5在分類學(xué)地位上初步確定是歸屬于腸桿菌屬Enterobacter。

目前，國內(nèi)外關(guān)于多菌靈降解菌的報(bào)道很少，分離到的多菌靈降解菌有紅平紅球菌Rhodococcus erythropolis［12-13］和 Rhodococcus qingshengii sp.nov.［14］、羅爾斯通氏菌屬 Ralstonia sp.［15］、短小芽孢桿菌 Bacillus pumilus［16］、假單胞菌屬 Pseudomonas sp.［17］、木霉 Trichonderma sp.［18］、諾卡氏菌 Nocardioides sp.SG-4G［19］、巴西固氮螺菌 Azospirillum brasilense［20］，尚未見關(guān)于 Enterobacter菌屬降解多菌靈菌株的報(bào)道。

<1)，且各件產(chǎn)品是否為不合格品相互獨(dú)立．

2.2 純培養(yǎng)條件下菌株的降解特性

2.2.1 初始pH值變化對降解能力的影響

為考察培養(yǎng)基的初始pH值對菌株D5降解作用的影響，將菌株D5接種于含100 mg·L-1多菌靈的不同pH緩沖液中，在20℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)12 d。菌株D5在不同pH值條件下的多菌靈的降解率如圖2所示。由圖2可知，無機(jī)鹽培養(yǎng)基初始pH值對菌株D5降解多菌靈有較大影響，強(qiáng)酸(pH值5.0)和強(qiáng)堿(pH值10.0)均不利于菌株D5的生長和對多菌靈的降解;菌株D5在pH值6.0～9.0均能生長，而最適生長 pH 值為 6.0～7.0，8 d后的降解率分別為100%和82.34%。

圖2 不同初始pH值對多菌靈降解的影響

2.2.2 溫度變化對降解能力的影響

溫度是影響微生物降解農(nóng)藥等有機(jī)污染物的主要環(huán)境因素之一。本研究對菌株D5在不同溫度下(5、10、15、20、25、30、35 ℃)多菌靈的降解特性進(jìn)行研究，結(jié)果如圖3所示。圖3結(jié)果表明，在5～30℃，菌株D5對多菌靈均具有降解能力;在溫度為15和20℃時(shí)，菌株D5對多菌靈降解效果好，分別在培養(yǎng)12和8 d時(shí)降解率達(dá)到100%。菌株D5在溫度為5和30℃時(shí)，仍具有一定降解效果，培養(yǎng)12 d后降解率分別為24.26%和47.42%;溫度為 25℃時(shí)，菌株D5對多菌靈的降解效果明顯不如20℃，降解率僅為74.38%;當(dāng)溫度超過20℃時(shí)，隨著溫度的升高，降解率逐漸降低。由此可見，菌株D5在10～25℃的低溫條件下具有較強(qiáng)的降解活性。

圖3 不同溫度對多菌靈降解的影響

目前，已經(jīng)分離的多菌靈降解菌多屬于中溫菌，最佳降解溫度均在25～35℃［12-20］，菌株D5在10～20℃的條件下對多菌靈的降解效果明顯優(yōu)于25℃以上的溫度，按照Morita的定義屬于耐冷菌。因此，菌株D5對北方多菌靈污染土壤的低溫生物修復(fù)與其它菌株相比具有很大的優(yōu)勢。

2.2.3 菌株D5對不同質(zhì)量濃度多菌靈降解效果

由圖4可見，在pH值7.0、20℃條件下培養(yǎng)時(shí)，菌株D5對多菌靈的耐受質(zhì)量濃度高于250 mg·L-1，完全降解初始質(zhì)量濃度為 50、100、150、200 mg·L-1的多菌靈所需的時(shí)間分別為4、8、10、12 d。由此可見，多菌靈的初始質(zhì)量濃度對菌株D5的降解率有較大的影響，在12 d內(nèi)多菌靈的初始質(zhì)量濃度越高，降解率越低。

圖4 菌株D5對不同質(zhì)量濃度多菌靈的降解效果

2.2.4 營養(yǎng)基質(zhì)對菌株降解多菌靈的影響

在處理液中加入外源氮素營養(yǎng)基質(zhì)可以顯著提高菌株對多菌靈的降解效果，見圖5。隨著外源氮素基質(zhì)的加入，菌株D5對多菌靈的降解量明顯增加，以加入蛋白胨時(shí)菌株D5對多菌靈的降解量最大，在6 d后達(dá)到100%，菌體生長量的增加可能是在外源氮素基質(zhì)存在條件下多菌靈的降解速率加快的原因，并且外源氮素基質(zhì)的加入沒有抑制多菌靈的降解。從圖5結(jié)果對比來看，有機(jī)氮源的加入促降解作用明顯優(yōu)于有機(jī)碳源，且菌株D5在利用外源碳源營養(yǎng)基質(zhì)的同時(shí)不能利用多菌靈作為碳源，菌體的量的增加較以多菌靈為唯一碳源的多，隨著外源碳源基質(zhì)的消耗，多菌靈的降解量逐漸增多。

圖5 不同營養(yǎng)基質(zhì)對菌株D5降解率的影響

這表明，在使用菌株D5進(jìn)行多菌靈污染土壤修復(fù)時(shí)，外加有機(jī)氮源可以促進(jìn)多菌靈的生物降解，這與朱鳳曉等［21］添加少量氮源可以促進(jìn)復(fù)合菌對多菌靈的降解的研究結(jié)果是一致的，但與張麗珍等［16］關(guān)于尿素會抑制短小芽胞桿菌NY97-1降解多菌靈能力的研究結(jié)果相反。

2.2.5 菌株生長與降解多菌靈的關(guān)系

如圖6所示，菌株D5在20℃，pH值7.0的最適生長條件下，能以多菌靈為唯一碳源生長，菌株D5的生長曲線和多菌靈的降解曲線相吻合。該圖也表明，菌株生長沒有明顯的滯后期，培養(yǎng)2 d后進(jìn)入對數(shù)生長期，隨著細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的增多，多菌靈的降解量也逐漸增大，當(dāng)培養(yǎng)8 d時(shí)多菌靈的降解率達(dá)到100%，說明該菌株在20℃、pH值7.0的生長條件下，能較快適應(yīng)環(huán)境并利用多菌靈作為生長基質(zhì)。

圖6 最優(yōu)條件下菌株D5生長和多菌靈降解情況

3 結(jié)論

綜上所述，從長期施用多菌靈土壤中分離得到1株耐低溫的多菌靈高效降解菌Enterobacter sp.D5具有較好的多菌靈降解能力，菌株D5能以多菌靈為唯一碳源生長，在15℃、pH值7.0的最適生長條件下12 d可完全降解100 mg·L-1多菌靈，外加氮源可以有效促進(jìn)多菌靈的生物降解，這為該菌株用于多菌靈污染土壤的低溫生物修復(fù)提供了良好的材料和理論依據(jù)。

致謝:多菌靈標(biāo)樣由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)逯忠斌教授提供;馬秀蘭副教授和撫松市環(huán)境監(jiān)測站對樣品采集給予的幫助，在此表示感謝。

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