UPLC–MS–MS法快速測定含乳冷凍飲品中氯霉素殘留量

佘曉麒，韓飛，朱虹，黃皓

（廣東省汕頭市質量計量監督檢測所，廣東汕頭 515041）

氯霉素（chloramphenicol）對各類家禽、家畜、水產品及蜂蜜制品以及各種傳染性疾病的預防、控制和治療均起重要作用，因而被廣泛使用，甚至被超量濫用，由此導致消費終端食品中含有氯霉素藥物殘留[1–2]。國內外研究機構發現，食品中殘留過量的氯霉素對人體有毒副作用，能抑制造血機能，容易引起人體血小板減少性紫癲、粒細胞缺乏癥、再生障礙性貧血和溶血性貧血等多種危害，特別是對早產兒和新生兒產生較為嚴重的毒性。目前許多國家都禁止在食用性動物飼養和治療過程中使用氯霉素[3]，即食用性動物組織和動物源食品中氯霉素不得檢出。

目前，對水產品、蜂產品、動物組織等基質中氯霉素的檢測方法較多，主要有微生物法、酶聯免疫法、放射性免疫法、金標試紙條法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜–質譜聯用法、液相色譜–質譜聯用法等[1，4–6],但對含乳冷凍飲品（雪糕、老冰棍等）中氯霉素殘留量的檢測方法較少。

超高效液相色譜–串聯質譜聯用技術（UPLC–MS/MS）具有快速、靈敏度高、專一性好、不受化學噪聲干擾等特點，尤其是通過多反應監測模式（MRM）能進一步提高檢測的靈敏度和選擇性，大大降低了檢測限和假陽性。筆者采用UPLC–MS分析含乳冷凍飲品中氯霉素殘留量的方法，以UPLC作為分離手段，有效節省了分析時間和流動相的消耗量，采用MS–MS對氯霉素進行測定，有效降低了假陽性的出現概率，提高了檢測的準確性和靈敏度。該法可為質檢技術機構監控含乳冷凍飲品中氯霉素殘留量提供一種快速準確的檢驗方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜–串聯質譜聯用儀：ACQUITY UPLC–Xevo型，美國 Waters公司；

氮吹儀：HCG–36型，天津市恒奧科技發展有限公司；

氯霉素標準品（250 mg）：德國Dr Ehrenstorfer公司；

乙酸乙酯、甲醇、乙腈、丙酮、正己烷：色譜純，美國TEDIA公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BHE C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A：0.1% 甲酸水；流動相B：乙腈；流速：0.45 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：30℃；運行時間：6 min；梯度洗脫條件：0～0.5 min，10%B，0.5～1.5 min，10%～40%B，1.5～3.0 min，40%～80%B，3.0～3.5 min，80%～95%B，3.5～4.5 min，95%B，4.5～6.0 min，95%～10%B。

1.3 質譜條件

電噴霧接口[ESI]：負離子模式電離；離子監測模式：多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓：2.5 kV；離子源溫度：150℃；霧化氣溫度：400℃；霧化氣流量：900 L/min；錐孔氣流速：20 mL/min；其它條件見表1。

表1 氯霉素多反應監測條件

1.4 樣品前處理

將含乳冷凍飲品室溫解凍，混勻后取約30 mL冷凍飲品置于50 mL的離心管中，加入20 mL乙酸乙酯–高氯酸混合液（體積比99∶1），劇烈振搖 10 min后 超 聲 10 min，以 6 000 r/min離 心15 min，準確移取10 mL上層有機溶液，用氮吹儀吹干后，用1.0 mL流動相溶解殘渣，再加入3 mL正己烷渦旋1 min，分層后棄去上層正己烷，水層用0.22 μm有機濾膜過濾，供UPLC–MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件

以ACQUITY BHE C18色譜柱作為分析柱，比較了不同流動相對靈敏度、分離度、峰形等的影響。結果顯示，水的酸堿度對于氯霉素分離影響不大，對質譜監測也無顯著影響；有機相使用乙腈比使用甲醇時的氯霉素色譜峰形好，而且使用乙腈作為有機流動相更有利于ESI源中溶劑的去除；同時以乙腈–水作為流動相具有更高的質譜響應。因此實驗采用0.1%甲酸水溶液–乙腈作為流動相。

2.2 質譜條件

氯霉素分子式為C11H12Cl2N2O5，在電噴霧源(ESI)中易失去一個氫原子而帶負電荷，故選擇ESI負離子模式對其進行檢測。用流動注射進樣方式對氯霉素的母離子進行掃描，得到其準分子離子峰，以適當的碰撞能量對準分子離子進行子離子掃描，選擇響應值最強的子離子作為定量離子，選擇響應值相對較強的離子作為定性離子。選擇MRM掃描模式對母離子與子離子進行碎裂電壓及碰撞能量的優化，優化后的參數見表1。從質譜圖中選擇兩個信號較強的子離子m/z152.0和m/z257.0，以m/z257.0作為定性離子（圖1 A），離子峰度最強的m/z152.0為定量離子（圖1 B）。圖1C為氯霉素總離子流圖，氯霉素保留時間為2.44 min。

圖1 添加氯霉素標準樣的含乳冷凍飲品樣品UPLC–MS/MS譜圖

2.3 樣品前處理方式與優化

氯霉素可以用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等有機溶劑提取，其中乙酸乙酯對氯霉素的提取效率最高；乙酸乙酯–高氯酸混合液（體積比99∶1）與堿性乙酸乙酯溶液分別提取氯霉素時，乙酸乙酯–高氯酸混合液能更有效地消除含乳冷凍飲品中的基體干擾；1次正己烷脫脂，可有效去除樣品中的脂肪。實驗將乙酸乙酯–高氯酸混合液抽提濃縮干燥后，經正己烷脫脂后的樣品，再進一步用Oasis HLB柱和C18柱凈化，UPLC–MS/MS結果顯示，在MRM色譜圖中，過柱樣品和未過柱樣品都幾乎沒有干擾峰，且Oasis HLB柱和C18柱相比，柱凈化結果無顯著性差異，說明其前處理方式效果比較好，也有可能是因為含乳冷凍飲品中基體比較簡單。

2.4 工作曲線方程及檢出限

將氯霉素標準溶液逐級稀釋后，配制質量濃度分別為 0.1，0.2，1.0，5.0，10.0，50.0，100.0 ng/mL 的標準工作溶液，并進行UPLC–MS–MS測定。以定量離子對（m/z320.9,152.0）的峰面積A對氯霉素質量濃度c（ng/mL）進行線性回歸，得回歸方程為A=61.6821c+578.297，線性相關系數r=0.998 6。對添加1.0 μg/kg的氯霉素樣品進行測定，定量離子對的信噪比為32.4，以信噪比（S/N）等于3時計算氯霉素的檢出限，得到本方法檢出限為0.1 μg/kg。

2.5 回收率和精密度試驗

對含乳冷凍飲品中的雪糕、三色雪糕、老冰棍樣品進行測定，并進行加標回收試驗，添加量的濃度為 0.5，1.0，2.0 μg/kg，每個水平進行 5次平行測定，測定數據見表2。由表2可知3種水平的加標回收率為81.5%～103.4%，測定結果的相對標準偏差為1.72%～3.18%，符合食品檢驗分析的要求。

表2 回收率和精密度試驗結果（n=5）

3 結論

采用超高效液相色譜–串聯質譜聯用技術測定含乳冷凍飲品中氯霉素含量，針對不同的含乳冷凍飲品，前處理方法可稍做調整，如含有全脂奶粉較多的冷凍飲品，脂肪含量較高，可適當增加離心的速率，延長離心時間，增加正己烷脫脂程序；對于成分復雜的樣品，建議前處理過程使用Oasis HLB柱和C18柱，可有效保護色譜柱和質譜儀，這些措施都有利于樣品中氯霉素的提取和檢測。

UPLC–MS/MS法測定含乳冷凍飲品中的氯霉素，具有方法特異性強、分析周期短、樣品前處理簡單、靈敏度高、適用范圍廣等優點。方法的回收率及精密度均滿足殘留分析要求，適合用于含乳冷凍飲品中氯霉素殘留的分析，為質檢技術機構監控含乳冷凍飲品中氯霉素殘留量提供了一種快速準確的檢驗方法。

[1] 王自良，趙坤，張改平.氯霉素的毒性及其在動物性食品中的殘留與檢測[J].河南科技學院學報，2005(6): 101–105.

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[3] GB/T 22338–2008 動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定[S].

[4] Forti A F，Campana G，Simonella A，et al. Determination of Chloramphenicol in Honey by Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry [J]. Analytica Chimica Acta，2005，529(2):257–263.

[5] 魏林陽，徐金晶，吳紅軍.水產品中氯霉素殘留的氣質聯用法檢測[J].光譜實驗室，2007，24(2): 201–205.

[6] 謝文，丁慧瑛，章曉氡，等.高效液相色譜串聯質譜法測定蜂蜜、蜂王漿中氯霉素殘留[J].分析化學，2005，33(12): 61–64.