糖尿病腎病患者血清miRNA-93的表達變化及意義

楊 陽，張運津，謝 安，汪 泱，婁遠蕾

(1、南昌大學第一附屬醫院泌外研究所，江西 南昌 330006；2、南昌大學附屬口腔醫院；3、江西廣濟醫院)

miRNA 作為天然的基因調控因子在胚胎發育、細胞分化、血管形成、腫瘤發生等許多重要病理生理過程中發揮著重要的調控作用[1]。大量研究表明差異表達的miRNA與許多疾病的發生發展有關[2-4]，有望成為其早期診斷標志物和潛在的治療靶點。雖然目前研究表明miRNA 參與糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發生發展，但都是基于動物模型和體外實驗，而臨床DN的相關研究目前鮮見報道。本文通過分析現有文獻報道，選擇miRNA-93 進行實時熒光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 檢測，分析其在糖尿病腎病患者血清和健康對照組血清的表達差異；探討其與DN 發生、發展等之間的關系，以明確其在DN 發生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2010年8月—2011年3月在南昌大學第一附屬醫院腎內科確診為DN的患者為研究對象。收集其血清標本共計20例。其中男性8例，女性12例；年齡33～76歲，平均52.8歲；DN 臨床分期：Ⅰ期-Ⅳ期(非尿毒癥組)12例，Ⅴ期(尿毒癥組)8例。對照組為20例健康體檢的正常血清。所有標本-80℃保存。以上標本收集均通過醫院倫理委員會批準并簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。其它常規化學試劑均為分析純產品。Tpersonal PCR 儀(德國Biometra)，實時定量PCR 儀step one plus(美國ABI)。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 檢測miRNA-93的表達 按miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒說明書操作。以U6為內參，引物序列及PCR 產物片斷大小為：miRNA-93 上游CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG，下游引物為試劑盒提供的通用引物，擴增產物為76bp；U6 上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下 游：AACGCTTCACGAATTTGCGT，擴增產物為94bp。數據采用2-△△CT法進行分析。

1.3.2 生物信息學預測miRNA-93 靶基因 采用targetScan (http://www.targetscan.org)、PicTar (http://picTar.mdc -berlin.de)、miRanda (http://microrna.sanger.ac.uk)、miRDB (http://miRNAdb.org/miRDB)4個軟件在線預測miRNA-93 靶基因。

1.3.3 統計學分析 以上實驗重復3 遍，實驗數據用中位數和四分位數間距[M(P25,P75)]表示，采用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析。獨立樣本比較應用非參數Mann-Whitney 檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 DN組和健康對照組血清miRNA-93的表達情況 qRT-PCR顯示miRNA-93 在DN組的表達明顯低于健康對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 兩組血清標本miRNA-93表達比較

2.2 miRNA-93的表達與DN 臨床病理參數間的關系 尿毒癥組患者血清miRNA-93表達水平明顯低于非尿毒癥組患者，差異有有統計學意義(P＜0.05)。不同的性別、年齡之間無差異。見表1。

表1 miRNA-93的表達與DN 臨床病理參數間的關系

2.3 miRNA-93 靶基因預測 TargetScan 預測miRNA-93 靶基因為50個，PicTar 預測為613個，mi-Randa 預測為9156個，miRDB 預測為293個。預測的結果顯示miRNA-93 調節的靶基因范圍非常廣泛，涉及血管形成、信號轉導、細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化等各個方面。其中6個基因與DN 相關：VEGFA、MTHFR、ADRA2B、SDC2、APOB、PPARG。

3 討論

DN 是導致糖尿病(DM)患者死亡的主要原因，也是尿毒癥的第二病因，因此DN 嚴重危害DM 患者的健康與生命，加重社會與家庭的經濟負擔。但是由于DN 起病隱匿，進展緩慢，早期臨床癥狀不典型，而臨床一旦出現蛋白尿時，其進程難以逆轉，大約7年內有50%進入尿毒癥期，最終發展為終末期腎病(ESRD)。因此，DN的早期診斷和治療就成為目前亟待解決的問題。miRNA 作為天然的基因調控因子在胚胎發育、細胞分化、血管形成、腫瘤發生等許多重要病理生理過程中發揮著重要的調控作用[1]，有望成為許多疾病的早期診斷標志物和潛在的治療靶點。

目前研究表明miRNA 參與DN的發生發展。Kato[5]研究組采用芯片、qRT-PCR、質粒轉染及流式細胞術等方法進行體內、體外實驗，結果表明在小鼠糖尿病動物模型和小鼠腎系膜細胞中miRNA-192表達上調；miRNA-192的靶基因為smad-l 作用蛋白(slPl)；slPl 是TGF-β-smad 通路的重要內源性阻遏物，高表達的miRNA-192 通過對sIPl 抑制促進TGF-β 介導的腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質的合成，從而導致糖尿病腎病的發生發展。該研究小組[6]也證實，在糖尿病腎病動物模型中，高表達的miRNA-216a 通過下調靶基因YB-1 蛋白(一個RNA 連接蛋白)調節TGF-β1的翻譯。TGFβl 是細胞外基質蛋白的一個主要調控因子。Long[7]等研究表明miRNA-29c 在小鼠DN 模型的腎小球、高糖處理的足突細胞及微血管內皮細胞中都有表達，并能誘導細胞凋亡和細胞外基質蛋白的積累；并證實miRNA-29c的靶基因為信號轉導調控因子Spry1,過表達的miRNA-29c 通過下調Spry1 促進Rho 激酶的活化；敲除miRNA-29c 能減少動物模型的蛋白尿和細胞外基質纖維連接蛋白的積累。提示miRNA-29c 通過Spry1/Rho 通路促進DN的進展。使用同樣的技術方法，Long[8]還證實miRNA-93的靶基因是血管內皮生長因子A(VEGFA)。轉染miRNA-93 能抑制VEGFA 3’-UTR的轉錄和使高糖環境誘導的VEGFA 蛋白分泌減少；相反，使用miRNA-93 抑制劑后則使VEGFA的表達迅速增加。VEGFA 是一種二聚體糖蛋白，在血管生成、血管的內穩態平衡和維持毛細血管軍完整性等方面具有重要作用，特別是在腎小球的形成和功能方面具有重要的調節作用。在DN 動物模型腎臟中，VEGFA 是高表達的，干擾其表達后腎功能得到明顯改善。

已有的研究都是基于動物模型和體外實驗，對臨床DN的相關研究目前鮮見報道。本課題通過對現有文獻報道的分析，利用qRT-PCR 方法檢測miRNA-93 在糖尿病腎病患者血清和健康對照組血清的表達情況，發現miRNA-93 在DN組的表達明顯低于健康對照組，尿毒癥組患者血清miRNA-93表達水平明顯低于非尿毒癥組患者，提示miRNA-93可能在在糖尿病腎病發生過程中起著重要作用。靶基因預測分析的結果顯示miRNA-93 調節的靶基因范圍非常廣泛，涉及血管形成、信號轉導、細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化等各個方面。其中6個基因與DN 相關，分別是：VEGFA、亞甲基四氫葉酸還原酶 (MTHFR)、α-2B 腎上腺素受體(ADRA2B)、多配體聚糖2 (SDC2)、載脂蛋白B(APOB)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)。推測在DN 中，低表達的miRNA-93可能通過下調其靶基因來發揮作用，從而參與DN的發生發展，但具體機制尚有待進一步研究。

[1]Filip A.miRNA--new mechanisms of gene expression control[J].Postepy Biochem,2007,53(4):413-419.

[2]吳 玨,劉 芬,阮瓊芳,等.miRNA-92a 在缺血再灌注腎損傷中的表達變化[J].實驗與檢驗醫學,2010,28(1):9-11.

[3]陳欽開,王滿庭,楊 柳,等.多囊腎患者家系血清miRNA-15a和miRNA-17表達水平的比較[J].實驗與檢驗醫學,2011,29(1):1-2.

[4]楊 陽,張運津,崔蘇萍,等.microRNAs 在腎透明細胞癌組織中的表達及意義[J].實驗與檢驗醫學,2012,30(2):119-122.

[5]Kato M,Zhang J,Wang M，et al.MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruli and its function in TGF-β-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(9):3432–3437.

[6]Kato M,Wang L,Putta S，et al.Post-transcriptional up-regulation of Tsc-22 by Ybx1,a target of miR-216a,mediates TGF-{beta}-induced collagen expression in kidney cells [J].J Biol Chem,2010,285(44):34004-34015.

[7]Long JY,Wang Y,Wang WJ,et al.MicroRNA-29c is a signature microRNA under high glucose conditions which targets sprouty homolog 1,and Its In vivo knockdown prevents progression of diabetic nephropathy[J].J Biol Chem,2011,286(13):11837-11848.

[8]Long JY,Wang Y,Wang WJ,et al.Identification of microRNA-93 as a novel regulator of vascular endothelial growth factor in hyperglycemic conditions[J].J Biol Chem,2010,285(30):23457-23465.