肺炎衣原體實時定量PCR 檢測方法的建立

李林海，陳麗丹，廖楊，陳建蕓，石玉玲

(廣州軍區廣州總醫院檢驗科，廣東廣州 510010)

肺炎衣原體(chlamydia pneumonia，Cpn)是一種在細胞內寄生的革蘭染色呈陰性的微生物，是20世紀80年代發現的呼吸道致病微生物，可引起哮喘、肺炎以及急性支氣管炎等疾病［1-3］。Cpn主要通過呼吸道的分泌物進行傳播，因此，在人口較為密集的地方很容易出現流行。目前臨床上檢測肺炎衣原體的方法很多，主要有細胞培養分離法、直接或間接免疫熒光法、酶聯免疫吸附法以及多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)法，但是以上方法均存在一定的局限性［4-5］。我院針對Cpn建立了實時定量PCR檢測方法，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 對象

研究對象為2010年1月至2011年5月于我院住院治療的呼吸道感染患者，共200例，其中男124例，女76例，年齡4～67歲，平均34.5歲。所有患者均采集咽拭子樣本，其中68例患者采集肺泡沖洗液樣本。

1.2 材料、試劑和儀器

呼吸道病原微生物(肺炎支原體、肺炎雙球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒等)由本院保存。

Cpn PCR根據primer 5.0設計由上海英駿生物公司合成;SYBR Green通用型qPCR Master Mix購自羅氏生物;Real-time PCR擴增儀購自Applied Biosystems;TWAR免疫熒光試劑盒購自美國Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計 根據GenBank已公布的肺炎衣原體基因序列，選取高特異和高保守的16S核糖體蛋白基因設計 PCR引物，引物序列如下:CpnF:5'-TGA AGT CGG AAT TGC TAG TAA TGG-3';CpnR:5'-GTG TGT ACA AGG CCC GGG AAC-3'。擴增基因片段長度為450 bp。

1.3.2 基因組 DNA的提取 將500 μl Cpn、肺炎支原體、肺炎雙球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒等標準液置于1.5 ml離心管中，再加入等體積的酚 ∶氯仿 ∶異戊醇(25 ∶24 ∶1)，在4 ℃下以12 000 r·min－1離心15 min，吸取上清;并向上清加入等體積預冷的異丙醇和1/10體積3 mmol·L－1醋酸銨溶液，輕輕混勻后，置于冰上30 min;待有絮狀物形成后4℃下12 000 r·min－1離心15 min，棄上清;用70%冰乙醇洗滌沉淀2次，4 ℃下12 000 r·min－1離心 15 min，棄上清;最后溶解于50 μl TE緩沖液中，－20℃保存作為引物特異性分析的模板。

1.3.3 RT-PCR反應 反應體系:2×SYBR Green mix 12.5 μl，CpnF/CpnR 引物(10 μmmol·L－1)各 1 μl，模板1 μl，補雙蒸水至終體積為25 μl。將上述的反應液加入 real time PCR 管中，以1 000 r·min－1離心 1 min，使反應液全部甩到管底。然后將PCR管放入PCR儀中進行反應，反應采用兩步法進行。預變性:95℃，30 s;變性:95℃，3 s;退火延伸:60℃，30 s;構建溶解曲線。反應結束后對結果進行分析。

1.3.4 引物特異性分析 將Cpn、肺炎支原體、肺炎雙球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒的基因組DNA稀釋到50 ng·μl－1，按上述PCR反應體系以及條件進行反應，分析引物的特異性;將 Cpn的基因組DNA 倍比稀釋為 6 個不同的濃度(200.0、40.0、8.0、1.6 ng·μl－1，320.0、64.0 pg·μl－1)，模板 1 μl，按照上述反應體系和條件分析PCR的最低DNA檢出濃度。

1.3.5 RT-PCR檢測臨床樣本 直接以咽拭子樣本和肺泡沖洗液樣本作為模板，模板5 μl，按上述反應體系和條件進行PCR，分析樣本的陽性率。

1.3.6 免疫熒光檢測臨床樣本 采用免疫熒光呼吸道6種病原體IgM+IgG聯合檢測試劑盒，對咽拭子樣本和肺泡沖洗液樣本進行分析。6種呼吸道病原菌分別為Cpn、肺炎支原體、肺炎雙球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒。

2 結 果

2.1 引物特異性以及溶解曲線分析

本實驗以肺炎支原體、肺炎雙球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒為對照，分析Cpn CpnF/CpnR引物的特異性。實驗結果如圖1所示，肺炎支原體、肺炎雙球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒等均呈陰性，而肺炎衣原體呈陽性。由圖2可知，熔解曲線峰單一，說明引物特異性高，無非特異產物出現。

圖1 CpnF/CpnR引物的特異性分析Fig 1 The specificity analysis of CpnF/CpnR primer

圖2 CpnF/CpnR引物的熔解曲線Fig 2 The melt curve of CpnF/CpnR primer

2.2 敏感性和線性范圍

肺炎衣原體標品DNA以1∶5連續稀釋6個濃度梯度后(200.0、40.0、8.0、1.6 ng·μl－1，320.0、64.0 pg·μl－1)作為PCR的模板，進行實時定量PCR擴增。擴增曲線如圖3所示。

圖3 不同濃度肺炎衣原體標準DNA擴增曲線Fig 3 The amplification curve of Cpn standard DNA of different concentrations

由圖3可知，6個濃度的標準DNA模板均呈陽性，采用本方法可以測得的最低DNA濃度為64 pg·μl－1，當低于 64 pg·μl－1時擴增曲線的重復性較差，因此，該方法可以檢測的線性范圍為 64.0 pg·μl－1～200.0 ng·μl－1，模板濃度在此范圍內可以進行精確的定量。

2.3 臨床樣本檢測分析

分別對200例患者的咽拭子樣本和68例患者的肺泡沖洗液樣本進行了RT-PCR檢測，同時與熒光免疫檢測的結果進行比較，結果見表1。

表1 RT-PCR和免疫熒光法對咽拭子和肺泡沖洗液中肺炎衣原體的檢出率比較Tab 1 The detection rate analysis of chlamydia pneumoniae between RT-PCR and immunofluorescence in clinical samples

如表1所示:RT-PCR對咽拭子和肺泡沖洗液中的Cpn陽性檢出率分別為94.34%和84.61%，免疫熒光法的陽性檢出率分別為83.02%和73.08%。RTPCR的檢出率高于免疫熒光法。

3 討 論

Cpn感染在呼吸道疾病的發生中占有很大的比例，目前臨床上診斷的方法有細胞培養分離法、直接或間接免疫熒光法以及PCR法［6-7］。細胞培養法操作復雜，周期較長，分離效率較低，不適合臨床快速檢測［8］。抗體免疫熒光檢測法是一種比較靈敏的方法，但是由于Cpn與沙眼衣原體之間存在抗原交叉反應，給診斷帶來了一定的困難;同時Cpn IgM抗體一般在患者發病后1周后才能檢測到，而且免疫系統發育不完全患者出現假陽性的比率較高［9］。多聚酶鏈反應在臨床檢測Cpn感染中也被廣泛使用，但是該技術只能對Cpn感染作定性分析，無法定量［10］。

近年來，隨著熒光定量PCR的問世，該技術迅速應用于臨床診斷。熒光定量PCR具有可實時監測、準確性高、效率高等優點，并能降低PCR交叉污染問題。目前，常用的PCR定量方法有SYBR GreenⅠ隨機參入法和TaqMan探針法。TaqMan探針法特異性更高，但是其成本較高［11］;SYBR GreenⅠ隨機參入法無需探針，因此，成本低而且操作簡單，適合于臨床檢測。我們針對Cpn 16S核糖體蛋白的保守序列設計了一對熒光定量PCR，通過特異性分析顯示該引物具有極高的特異性，且在模板濃度 64.0 pg·μl－1～200.0 ng·μl－1范圍內具有極好的線性，并比較了RT-PCR和免疫熒光法的陽性檢出率，結果顯示RT-PCR的陽性檢出率高于免疫熒光法。本研究采用了200個咽拭子樣本和68個肺泡沖洗液樣本進行分析，通過大量的樣本比較，增加了研究的準確性。綜上所述，本實驗成功建立了臨床快速診斷Cpn的方法，靈敏度高且周期短，值得臨床推廣使用。

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