人CCR5基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其鑒定

程林，宋紅勇，吳喜林，吳稚偉

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共健康醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京 210093)

CC型趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5，CCR5)是G蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員，主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等細(xì)胞膜上，是人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)入侵機(jī)體細(xì)胞的主要輔助受體之一，也是HIV-1水平傳播和垂直傳播的最主要的輔助受體。因此，以CCR5為靶點(diǎn)的HIV-1受體拮抗劑受到越來(lái)越多的關(guān)注［1］。本研究通過(guò)構(gòu)建人CCR5真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步的CCR5基因疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

CHO-K1細(xì)胞和GHOST-X4細(xì)胞均為南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共健康醫(yī)學(xué)中心保存，生長(zhǎng)于含10%滅活胎牛血清(美國(guó) Gibco公司)、2 mmol·L－1L-谷氨酰氨的DMEM培養(yǎng)基中。含人CCR5的原核表達(dá)質(zhì)粒pETCCR5以及含熒光素酶(luciferase)報(bào)告基因的R5噬性HIV假病毒JR-FL均為本中心保存。高保真DNA聚合酶PrimeSTAR、T4 DNA連接酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自大連Takara公司。核酸內(nèi)切酶為美國(guó)Fermentas MBI公司產(chǎn)品。TRIzol試劑和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PE標(biāo)記的鼠抗人CCR5單抗2D7為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。去內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒以及用于檢測(cè)luciferase活性的細(xì)胞裂解液及底物均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank中人CCR5基因序列，用軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)引物。上游引物加入HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)和增強(qiáng)表達(dá)的Kozak序列［2］;下游引物均引入XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)。上游引物:5'-ACA GAA GCT TGGA TTA TCA AGT GTC-3'(實(shí)線為HindⅢ酶切位點(diǎn)，虛線示Kozak序列);下游引物:5'-GTGTCT CGA GTC ACA AGC CCA CAG ATA TTT CC-3'(實(shí)線示XhoⅠ酶切位點(diǎn))。引物由上海Invitrogen生物有限公司合成。

1.2.2 PCR擴(kuò)增人 CCR5基因 以原核表達(dá)質(zhì)粒pET-CCR5為模板，PCR擴(kuò)增人CCR5基因。反應(yīng)條件為94℃變性4 min，然后 98℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 80 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 含CCR5基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與序列鑒定 用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ雙酶切1 μg真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1和純化的PCR產(chǎn)物。酶切產(chǎn)物純化后用 T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取氨芐青霉素平板上的菌落，擴(kuò)增后通過(guò)核酸序列測(cè)定，選取100%同源的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-CCR5。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè) CCR5基因的轉(zhuǎn)錄 取2 μg重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CCR5，于6孔板內(nèi)，按照試劑盒說(shuō)明書轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞。陰性對(duì)照取2 μg pcDAN3.1載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1。轉(zhuǎn)染48 h后，用TRIzol試劑裂解細(xì)胞，按試劑說(shuō)明書提取基因組總RNA，取1 μg RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1 μl cDNA為模板，PCR擴(kuò)增CCR5基因，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定［3］。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜CCR5蛋白表達(dá) 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CCR5轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞48 h后，取2×105細(xì)胞，PBS洗滌后，用100 μl流式緩沖液重懸，加入2 μl抗人 CCR5熒光抗體，室溫避光反應(yīng)30 min，洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。pcDAN3.1載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1作為陰性對(duì)照組。

1.2.6 HIV-1假病毒感染實(shí)驗(yàn) 96孔板中接種GHOST-X4細(xì)胞1×104孔－1，培養(yǎng)過(guò)夜后，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-CCR5 0.2 μg·孔－1，48 h 后每孔加入200 TCID50的R5噬性HIV假病毒JR-FL，培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞，檢測(cè)luciferase活性。對(duì)照組轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒pcDNA3.1。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增人CCR5基因

以質(zhì)粒pET-CCR5為模板，PCR擴(kuò)增人CCR5基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在大約1 000 bp的位置上出現(xiàn)目的條帶(圖1)。

圖1 人CCR5基因的PCR擴(kuò)增Fig 1 The agarose gel electrophoresis analysis of PCR product of human CCR5 gene

2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CCR5的序列鑒定

重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CCR5核酸序列測(cè)定結(jié)果顯示，目的基因全長(zhǎng)1 059 bp。Blast結(jié)果進(jìn)一步表明，目的基因序列和GenBank中已經(jīng)登記的人CCR5基因序列100%同源。以上結(jié)果表明，人CCR5基因被成功克隆到pcDNA3.1中。

2.3 CCR5基因在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)

重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-CCR5轉(zhuǎn)染 CHO-K1 48 h后，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)CCR5基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在大約1 000 bp的位置上出現(xiàn)目的條帶(圖2)，表明pcDNA3.1-CCR5已成功導(dǎo)入CHO-K1細(xì)胞內(nèi)，并能正確轉(zhuǎn)錄合成mRNA。

圖2 RT-PCR鑒定CCR5基因的轉(zhuǎn)錄Fig 2 RT-PCR analysis of CCR5 gene transcription

為了進(jìn)一步鑒定該基因在蛋白水平的表達(dá)及膜定位情況，本研究用抗人CCR5蛋白的熒光抗體做流式分析，結(jié)果表明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CCR5 48 h后，約25.6%的CHO-K1細(xì)胞表面表達(dá)CCR5蛋白(圖3)。該結(jié)果進(jìn)一步表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CCR5被成功導(dǎo)入CHO-K1細(xì)胞內(nèi)，并得到正確的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及細(xì)胞膜定位。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜表面CCR5蛋白Fig 3 Flow cytometry detection of cell surface CCR5 protein

2.4 膜表達(dá)CCR5能夠介導(dǎo)R5噬性HIV假病毒的感染

HIV-1假病毒JR-FL感染被重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CCR5轉(zhuǎn)染的 GHOST-X4細(xì)胞48 h后，實(shí)驗(yàn)組luciferase活性是對(duì)照組的200倍以上，經(jīng)t檢驗(yàn)，P=0.003 99(圖4)，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CCR5后，使GHOST-X4細(xì)胞具備了被R5噬性HIV-1假病毒感染的能力，進(jìn)一步證實(shí)CCR5在GHOST-X4細(xì)胞內(nèi)得到正確表達(dá)和細(xì)胞膜定位，而且具有介導(dǎo)R5噬性HIV-1假病毒感染的功能。

圖4 熒光素酶活性檢測(cè)Fig 4 Relative luciferase unit of JR-FL infected GHOSTX4 cells

3 討 論

CCR5是β趨化因子(MIP-1α、MIP-1β和RANTES)的受體，主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等的細(xì)胞膜上，具有調(diào)控T細(xì)胞和單核和(或)巨噬細(xì)胞的遷移、增殖等免疫的功能。CCR5具有7個(gè)跨膜 α螺旋，結(jié)構(gòu)上分為:胞外N末端，3個(gè)胞外環(huán)(ECL1-3)，3個(gè)胞內(nèi)環(huán)和胞內(nèi)C末端。自1996年發(fā)現(xiàn)CCR5是HIV-1感染細(xì)胞的輔助受體以來(lái)，特別是在發(fā)現(xiàn)CCR5基因Δ32突變者在擁有正常的免疫功能和炎癥反應(yīng)的同時(shí)，還能夠抵抗HIV-1的感染或抑制感染后疾病的進(jìn)展之后［4］，以CCR5為靶點(diǎn)的HIV受體拮抗劑成為研究的熱點(diǎn)，且取得了明顯的進(jìn)展，目前主要有以下4種CCR5拮抗劑:趨化因子衍生物、非肽類小分子化合物、肽類化合物和單克隆抗體［5］。

CCR5的膜外結(jié)構(gòu)域包括N末端及3個(gè)胞外環(huán)，可為單克隆抗體提供多個(gè)抗原表位，而識(shí)別不同表位的單克隆抗體與CCR5結(jié)合后對(duì)R5噬性HIV病毒具有不同的抑制效應(yīng)［6］。CCR5通過(guò)其N末端和ECL2與HIV gp120相互作用，推動(dòng)膜融合過(guò)程，從而介導(dǎo)HIV感染細(xì)胞［7］。因此，識(shí)別CCR5 N末端和ECL2的抗體對(duì)R5病毒一般具有不同程度的中和作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)，識(shí)別ECL1的抗體能夠促CCR5內(nèi)化，下調(diào)細(xì)胞表面CCR5的量，從而抑制R5噬性HIV的感染［8］。

盡管已有多種 CCR5單克隆抗體如 PRO140、mAb004以及2D7進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)階段［9］，但 CCR5單克隆抗體具有潛在的過(guò)敏反應(yīng)，且長(zhǎng)期使用易導(dǎo)致耐藥毒株及中和抗-抗體等缺點(diǎn)。在HIV-1感染后長(zhǎng)期不進(jìn)展以及長(zhǎng)期暴露而未被感染的人群中發(fā)現(xiàn)，針對(duì)CCR5 ECL1、具有抑制R5噬性HIV-1感染的自身抗體［10］。這些因素推動(dòng)了 CCR5自身抗體的研究［11-12］。本研究構(gòu)建了能夠在真核細(xì)胞中正確表達(dá)、定位，且具有介導(dǎo)R5噬性HIV假病毒感染功能的人CCR5真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步的基因疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

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