HMGB1、VEGF和MMP-7的相關(guān)性及其與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系

史振軍，馬海芝，楊振淮，邱萬壽

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)院普外科，廣東 廣州 510130；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院普外科，廣東 廣州 510635）

高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1，HMGB1)在多種腫瘤中過度表達(dá)，其水平遠(yuǎn)高于相對(duì)應(yīng)的正常組織，且可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、病灶大小、浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)與腫瘤血管生成密切相關(guān),是促進(jìn)腫瘤血管生成的眾多因子中最重要的一種。基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)可融解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。我們用免疫組化方法檢測(cè)人結(jié)直腸癌組織中HMGB1、VEGF、及MMP-7表達(dá)情況,以探討三者在結(jié)直腸癌中的相關(guān)性及其與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2001年1月至2010年10月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣州市中醫(yī)院普外科病理診斷為結(jié)直腸癌的腫瘤組織70例、癌旁組織20例及內(nèi)鏡室正常黏膜組織20例。70例結(jié)直腸癌患者中，男性46例(46.9%)，女性24例(53.1%)；年齡最大76歲，最小29歲，中位年齡56歲，其中＜60歲33例，≥60歲37例；腫瘤直徑＜5 cm 34例，≥5 cm 36例；肝轉(zhuǎn)移20例；高分化27例，中低分化腺癌39例，黏液腺癌2例，管狀腺癌1例，腺瘤癌變1例；浸潤(rùn)深度達(dá)肌層22例，漿膜及漿膜外48例；根據(jù)UICC 2002年分期標(biāo)準(zhǔn)分期，Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～I(xiàn)V期36例；結(jié)腸癌37例，直腸癌33例。其他兩組一般資料與結(jié)直腸癌組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有可比性。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人HMGB1單克隆抗體、羊抗人MMP-7單克隆抗體SP試劑盒均購于北京中杉生物公司。微波爐(Leica公司)、復(fù)溫箱(Leica公司)、Leica1203型切片機(jī)(Leica公司)、Olympus顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)、Leica1220 型烤箱(Leica公司)、Olympus BH2光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 免疫組織化學(xué) 全部臘塊4 μm厚連續(xù)切片4張，用EnVision兩步法，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染、封片。免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：免疫組化染色陽性反應(yīng)為細(xì)胞漿或胞核中出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒。參考Kawasaki等[2]報(bào)道的方法，根據(jù)染色的強(qiáng)度及陽性細(xì)胞的面積判斷結(jié)果。每張切片陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分為四個(gè)等級(jí)。每張切片選擇有代表性的區(qū)域，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色面積＞20%為陽性，在200倍視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)共計(jì)5個(gè)視野，取其平均值避免隨意性。VEGF蛋白陽性染色定位于細(xì)胞胞漿(呈棕黃色顆粒)；HMGB1蛋白陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)(呈棕黃色顆粒)；MMP-7蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和胞膜上(呈棕黃色或淺棕色顆粒)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布。結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)包裝軟件進(jìn)行分析處理。根據(jù)數(shù)據(jù)特征進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、列聯(lián)表的關(guān)聯(lián)性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本實(shí)驗(yàn)所有免疫組化切片均由兩名病理科主治醫(yī)師雙盲法讀片，差異出現(xiàn)5%～10%，然后共同決定診斷。

2.1 HMGB1、VEGF、MMP-7 在結(jié)直腸正常組織、癌旁組織及結(jié)直腸癌中的表達(dá) 在正常組織中VEGF、MMP-7不表達(dá)，HMGB1僅1例表達(dá)；在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，分別為50例、52例、46例，在癌旁組織中低度表達(dá)，分別為6例、7例、4例。3項(xiàng)指標(biāo)各組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，見表1。

表1 HGM1、VEGF、MMP-7在結(jié)直腸正常組織、癌旁組織及結(jié)直腸癌中的表達(dá)[例（%）]

2.2 結(jié)直腸癌組織中VEGF、HMGB1、MMP-7的表達(dá)量與臨床指標(biāo)的關(guān)系 VEGF、HMGB1、MMP-7的表達(dá)與患者腫瘤部位、性別、年齡、腫瘤直徑大小無關(guān)，而與腫瘤的浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且隨著腫瘤的惡化程度、轉(zhuǎn)移其表達(dá)呈遞增性，說明三項(xiàng)指標(biāo)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織中VEGF、HMGB1、MMP-7的表達(dá)量與臨床指標(biāo)關(guān)系[例（%）]

2.3 VEGF、HMGB1、MMP-7在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性 經(jīng)列聯(lián)表的關(guān)聯(lián)性分析HMGB1、MMP-7、VEGF在結(jié)直腸癌的表達(dá)均具有顯著相關(guān)性(P＜0.01)。關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.6，說明三者具有較強(qiáng)的正相關(guān)性，協(xié)同促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，見表3。

表3 VEGF、HMGB1、MMP-7在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性

3 討 論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多階段、多基因參與的復(fù)雜過程。有學(xué)者提出多基因協(xié)同學(xué)說，認(rèn)為在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段至少有兩個(gè)及以上功能不同的異常激活的癌基因各自發(fā)揮著不同的作用，并在時(shí)間與空間上相互配合，協(xié)同促進(jìn)了細(xì)胞的癌變和轉(zhuǎn)移。

現(xiàn)已公認(rèn)，新生的微血管是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的第一站，隨著腫瘤微血管計(jì)數(shù)(MVD)的增加，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)潛能也明顯增加，腫瘤微血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在血管新生過程中起了至關(guān)重要的作用。VEGF是血管生成過程最重要的正向調(diào)控因子,與多種腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[3]。研究表明HMGB1在正常組織中很少表達(dá)，在組織損傷、炎癥、腫瘤等情況下表達(dá)增強(qiáng)，可能參與腫瘤的增殖、侵襲、分化及凋亡等，說明與惡性腫瘤的形成和發(fā)展相關(guān)[4]。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移必須穿越組織自然屏障向遠(yuǎn)離原發(fā)瘤部位移動(dòng)，細(xì)胞間基質(zhì)和基底膜組成的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)防御腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用，細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的天然屏障，基質(zhì)溶解必然會(huì)促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。有人認(rèn)為MMP-7是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中最直接、最重要的金屬蛋白酶[5]，同時(shí)可促進(jìn)腫瘤血管的生長(zhǎng)，在小血管、毛細(xì)血管末梢形成及血管內(nèi)皮基膜形成的過程中起重要作用。

本研究中：在20例結(jié)直腸正常黏膜標(biāo)本中VEGF、MMP-7不顯示；在20例結(jié)直腸癌旁組織VEGF、HMGB1及MMP-7陽性表達(dá)分別為6例、7例、4例，表達(dá)率分別為30%、35%、20%。而在惡性腫瘤中三項(xiàng)指標(biāo)陽性表達(dá)分別50例、52例、46例，表達(dá)率分別為71.4%、74.3%、65.7%。結(jié)直腸癌組織與癌旁組織、正常組織差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。所測(cè)結(jié)果高于國外相關(guān)報(bào)道，可能與我們所取研究對(duì)象多為進(jìn)展期有關(guān)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)VEGF、HMGB1及MMP-7在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤直徑大小、腫瘤部位無關(guān)(P＞0.05)，而與腫瘤的浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，并且隨著腫瘤惡性程度、TME分期等的進(jìn)展，其陽性表達(dá)呈遞增性。

經(jīng)列聯(lián)表的關(guān)聯(lián)性分析我們發(fā)現(xiàn)：HMGB1、MMP-7、VEGF在結(jié)直腸癌的表達(dá)均具有顯著相關(guān)性(P＜0.01)，其關(guān)聯(lián)系數(shù)I值均大于0.6，說明三者具有較強(qiáng)的正相關(guān)性，VEGF、MMP-7的蛋白表達(dá)與HMGB1的強(qiáng)表達(dá)明顯相關(guān)。

因此，筆者認(rèn)為：HMGB1、MMP-7、VEGF三者具有正相關(guān)性，相互影響，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而HMGB1可能通過誘導(dǎo)VEGF、MMP-7的表達(dá)而促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤新生血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制尚不清楚。因此，HMGB1、VEGF、MMP-7的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌的病理分期、預(yù)后判斷及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義，可作為較為可靠的聯(lián)合檢測(cè)指標(biāo)。

[1]Moe SE,Sorbo JG,Sogaard R,et al.New isoforns ofrat Aquaporin-4[J].Cenomics,2008,91(4)：367-377.

[2]Kawasaki H,Altieri DC,Lu CD.Inhibition of apoptosis by surviving predicts shorter survival rates in colorectal cancer[J].Cancer Res,1998,58：5071.

[3]Shimanuki Y,Takahashi K,Cui R,et al.Role of serum vascular endothelial growth factor in the p rediction of angiogenesis and prognosis for non-small cell lung cancer[J].Lung,2005,183(1)：29-42.

[4]Xiang YY,Wang DY,Tanaka M,et al.Expression of high-mobility group-1 mRNA in human gastrointestinal adenocarcinoma and corresponding non-cancerous mucosa[J].Int J Cancer,1997,74(1)：1-6.

[5]Loukopoulos P,Mungall BA,Straw RC,et al.Matrix metalloproteinases-2 and-9 involvement in canine tumors[J].Vet pathol,2003,40(4)：382-394.