MMP-13在膠質母細胞瘤中的表達及對患者術后生存期的影響

楊 波，唐伏秋

（廣州軍區武漢總醫院腫瘤科1、干部病房二科2，湖北 武漢 430070）

膠質母細胞瘤是顱內最常見的原發性惡性腫瘤，來源于神經上皮組織，病理學分級屬WHOⅣ級星形細胞瘤。常見的發病年齡為45～65歲，老年男性多見，多以顱內高壓癥狀或神經功能障礙癥狀起病、病程短、進展快、死亡率高。雖然目前臨床上采用了手術為主，輔以術后放療、化療、免疫治療的綜合治療措施，但膠質母細胞瘤的療效仍然不理想，患者生存期短，預后差。為了改善膠質母細胞瘤患者的預后，延長生存期，必須深入研究膠質母細胞瘤的增殖、侵襲的機制，尋找新的治療靶點。基質金屬蛋白酶是一種鋅離子依賴的蛋白水解酶家族，可以降解細胞外基質中的膠原、明膠、蛋白多糖、層粘連蛋白等多種成份，與結腸癌、肺癌、骨肉瘤等多種惡性腫瘤的增殖、侵襲密切相關[1-2]。為了解膠質母細胞瘤中基質金屬蛋白酶13(Matrix metalloproteinase-13，MMP-13)的表達及其與患者術后生存期之間的相關性，我們采用免疫組化學法檢測了31例膠質母細胞瘤患者組織標本中MMP-13的表達，比較MMP-13強表達組與弱表達組患者術后生存期的差異，報道如下：

1 資料與方法

1.1 標本來源 選取廣州軍區武漢總醫院2008年1月至2010年6月首次手術切除并經病理學證實的膠質母細胞瘤患者的石蠟組織標本31例，所有病例均系廣州軍區武漢總醫院神經外科住院患者，經過影像學及術后病理確診為膠質母細胞瘤，術前均未行放療、化療和免疫治療等抗腫瘤治療。其中男20例，女11例，年齡33～65歲，平均51.6歲。電話隨訪患者的生存期，隨訪日期截止至2011年6月1日。

1.2 主要試劑 小鼠抗人MMP-13單克隆抗體購自美國Abnova公司，即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒、DAB顯色試劑盒等試劑均購自福州邁新生物技術開發公司。

1.3 方法 采用免疫組化兩步法：以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS沖洗3次，每次3 min。高壓鍋煮沸對組織抗原進行修復，每張切片加1滴或50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl的小鼠抗人MMP-13單克隆抗體，4℃過夜。PBS液洗3遍，每次3 min，每張切片加1滴或50 μl即用型MaxVisionTM試劑，室溫下孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察1～3 min掌握顯色程度。自來水沖洗，蘇木素復染。之后切片經過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 MMP-13染色結果判定 MMP-13陽性表達的細胞中，胞漿呈程度不同、基本均勻的棕黃色顆粒反應，強表達者呈黃褐色。由兩名獨立的病理科醫師根據組織切片的染色強度和染色面積進行半定量染色評分，染色強度的評分標準是：0=陰性，1=弱陽性，2=陽性，3=強陽性；染色面積的評分標準是：0=陰性，Ⅰ＜10%，Ⅱ 10～50%，Ⅲ＞50%。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，術后生存期的比較用Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗。

2 結果

2.1 MMP-13在膠質母細胞瘤組織中的表達 如圖1所示，MMP-13在膠質母細胞瘤標本組織中的表達主要集中在腫瘤細胞的細胞漿，顯微鏡觀察呈程度不同的黃色、黃褐色染色。31例膠質母細胞瘤標本按照Tirapelli等[3]報道的膠質母細胞瘤免疫組化評分方法（詳見材料與方法1.4）判定染色評分，將染色強度與染色面積評分相加，總評分0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為陽性，5～6分為強陽性。其中MMP-7陰性表達7例，弱陽性表達8例，陽性和強陽性表達16例，總表達率（弱陽性表達組+陽性表達組+強陽性表達組）達77.4%。強表達組（陽性表達組+強陽性表達組）16例，占51.6%。弱表達組（陰性表達組+弱陽性表達組）15例，占48.4%。

圖1 免疫組化檢測膠質母細胞瘤組織MMP-13的表達(×200)

2.2 MMP-13表達的強弱與患者術后生存期的關系 31例膠質母細胞瘤患者中，MMP-13強表達組16例，刪除1例（患者仍生存）。MMP-13弱表達組15例，刪除3例（患者仍生存）。如圖2所示，MMP-13強表達組生存期明顯短于MMP7弱表達組（P＜0.0001，χ2=18.275)。

圖2 31例膠質母細胞瘤患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

膠質母細胞瘤是高度惡性的Ⅳ級星形膠質細胞瘤，可以是顱內原發，也可以由間變性星形細胞瘤進一步惡變而來，病理學又分為多形性膠質母細胞瘤和巨細胞型膠質母細胞瘤。膠質母細胞瘤鏡下可見瘤細胞密集，有明顯異型性，常常伴出血、壞死，血管內皮細胞明顯增生。腫瘤發展迅速，預后差，患者多在兩年內死亡[4]。惡性腫瘤的侵襲和轉移通常包括以下三個步驟：①腫瘤細胞粘附基底膜和細胞外基質，通過各種蛋白水解酶降解基底膜和細胞外基質成份；②腫瘤細胞在各種趨化因子的作用下聚集和移行；③腫瘤細胞隨血管和淋巴管轉移至他處繼續增殖。其中，細胞外基質的降解是惡性腫瘤侵襲的重要步驟，而基質金屬蛋白酶在這一過程中發揮著重要作用。

基質金屬蛋白酶可以分為5個亞類：膠原酶、明膠酶、間質溶解素、膜型基質金屬蛋白酶和其他類[5]。MMP-13與MMP-1、MMP-8同屬于膠原酶亞類，是基質金屬蛋白酶家族中一個重要的成員，它主要由腫瘤細胞和腫瘤間質細胞分泌，可以降解細胞外基質中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原等成份。特別是Ⅱ、Ⅳ型膠原，是MMP-13的主要作用底物[6-7]。近年來研究發現，MMP-13的高表達與乳腺癌、結腸癌、軟骨肉瘤的不良預后密切相關。Zhang等[8]用免疫組化法檢測了263例乳腺癌石蠟包埋組織標本，發現MMP-13蛋白主要表達于腫瘤細胞的胞質和腫瘤間質細胞，MMP-13在腫瘤細胞的表達（P＜0.001）和腫瘤間質成纖維細胞的表達（P＜0.001）都與腫瘤的淋巴結轉移有關。MMP-13在腫瘤細胞的表達與Her-2(P=0.015）和TIMP-1（P＜0.010）的表達也密切相關。MMP-13在腫瘤細胞的表達還與腫瘤的侵襲性表型密切相關。高水平表達的MMP-13與患者的不良預后有關，MMP-13是決定乳腺癌患者預后和生存的獨立因素。Elke等[9]用半定量RT-PCR法檢測了30例結腸癌組織和遠端正常腸黏膜組織中MMP-13表達，發現MMP-13 mRNA在腫瘤組織中的表達遠遠高于在正常腸黏膜組織中的表達（P=0.023）。Curran等[10]用免疫組化法檢測了90例Dukes'C結腸癌患者腫瘤組織中MMP-13的表達，發現MMP-13的表達強弱與患者的術后生存期呈反比，MMP-13是決定結腸癌患者預后和生存的獨立因素。

雖然MMP-13在乳腺癌、結腸癌、軟骨肉瘤中的表達與患者預后和生存密切相關，但其在膠質瘤中的表達研究資料尚不多。本研究結果顯示，MMP-13在膠質母細胞瘤組織中總表達率為77.4%，Kaplan-Meier生存曲線分析和Log-rank檢驗比較，MMP-13強表達組術后生存期明顯低于弱表達組，這表明MMP-13在膠質母細胞瘤中的表達可能與腫瘤的惡性增殖、侵襲等生物學行為密切相關，并影響膠質母細胞瘤患者的預后和術后生存。對于其通過影響哪些靶分子或靶基因來促進膠質母細胞瘤的增殖和侵襲，還有待于進一步的實驗研究。

[1]Klinge U,Rosch R,Junge K,et al.Different matrix micro-environments in colon cancer and diverticular disease[J].Int J Colorectal Dis,2007,22(5)：515-520.

[2]Morrison CJ,Butler GS,Rodríguez D.Matrix metalloproteinase proteomics：substrates,targets,and therapy[J].Curr Opin Cell Biol,2009,21(5)：645-653.

[3]Tirapelli LF,Bolini PH,Tirapelli DP,et al.Caspase-3 and Bcl-2 expression in glioblastoma：an immunohistochemical study[J].Arq Neuropsiquiatr,2010,68(4)：603-607.

[4]Clarke J,Butowski N,Chang S.Recent advances in therapy for glioblastoma[J].Arch Neurol,2010,67(3)：279-283.

[5]Sternlicht MD,Werb Z.How matrix metalloproteinases regulate cell behavior[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2001,17(1)：463-516.

[6]Knauper V,Lopez-Otin C,Smith B,et al.Biochemical characterization of human collagenase-3[J].J Biol Chem,1996,271(3)：1544-1550.

[7]Deng SJ,Bickett DM,Mitchell JL,et al.Substrate specificity of human collagenase 3 assessed using a phage-displayed peptide library[J].J Biol Chem,2000,275(40)：31422-31427.

[8]Zhang B,Cao XC,Liu YX,et al.Tumor-derived matrix metalloproteinase-13(MMP-13)correlates with poor prognoses of invasive breast cancer[J].BMC Cancer,2008,8(8)：83-92.

[9]Roeb E,Arndt M,Jansen B,et al.Simultaneous determination of matrix metalloproteinase(MMP)-7,MMP-1,-3,and-13 gene expression by multiplex PCR in colorectal carcinomas[J].Int J Colorectal Dis,2004,19(10)：518-524.

[10]Curran s,Dundas SR,Buxton J,et al.Matrix metalloproteinase/tissue inhibitors of matrix metalloproteinase phenotype identifies poor prognosis colorectal Cancers[J].Clinical Cancer Research,2004,10(24)：8229-8234.