N-乙酰-L-半胱氨酸對急性胰腺炎大鼠腦保護(hù)作用的實驗研究

史敬東，趙 晶，程 石，孫憶林，宋茂民

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050）

胰性腦病（PE）是一種繼發(fā)于急性胰腺炎（AP）的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其認(rèn)知功能改變，死亡率高，但是發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）是一種新型的抗氧化劑，有研究表明NAC是谷胱甘肽的前體，可抑制氧化張力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率。本研究通過建立AP大鼠模型，觀察通過注射NAC緩解AP時腦損害的發(fā)生和發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級SD大鼠90只，雄性，購自北京維通利華實驗動物有限公司。隨機(jī)分成3組：正常對照組30只，AP組30只，AP +NAC注射組30只。

1.2 AP動物造模型以及給藥方法

造大鼠AP模型[1]，大鼠術(shù)前12 h禁食，不禁水。1%戊巴比妥鈉（25 mg／kg）腹腔注射麻醉，正中切口入腹，于肝十二指腸韌帶肝門側(cè)用小動脈夾暫時夾閉胰膽管，由十二指腸前壁進(jìn)針，進(jìn)入胰膽管內(nèi)，夾閉膽胰管出口，以0.1mL/min勻速逆行注入5%牛磺膽酸鈉（0.1 mL/100 g）(購自Sigma公司)，10 min后去除動脈夾，關(guān)腹。AP+NAC組造完模型后立刻給予動物由陰莖背靜脈注射NAC（購自Sigma公司），劑量為200 mg/kg體質(zhì)量。24 h后取標(biāo)本。

1.3 腦組織含水量測定

采用常用的干重、濕重法測定：取出鼠腦的部分枕葉迅速用電子天平直接稱濕重，然后放在80℃烤箱中36 h烤干，測鼠腦的干重。腦組織含水量=（濕重一干重）÷濕重×100%。3組各隨機(jī)取10只。

1.4 腦組織TNF-α、MDA含量測定

取部分額葉腦組織按重量：冰生理鹽水體積的比（w／v）=1∶4常規(guī)制備20%的勻漿，用ELISA法測定腦組織勻漿中TNF-α的含量（試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司），按試劑盒操作說明的方法進(jìn)行；采用化學(xué)比色法檢測腦組織勻漿中MDA含量（試劑盒購自南京建成生物工程研究所）。3組各隨機(jī)取10只。

1.5 腦組織病理學(xué)觀察與微血管內(nèi)白細(xì)胞計數(shù)

常規(guī)HE染色，按孔雷等[2]的方法，光鏡下觀察、計算20個腦微血管斷面聚集附壁的白細(xì)胞總數(shù)，再求得每組的均數(shù)。3組各隨機(jī)取10只。

1.6 透視電鏡片制作

取大鼠海馬CA1區(qū)經(jīng)前固定、后固定、脫水、包埋后切片觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實驗結(jié)果

結(jié)果見表1。

2.1 腦組織水含量

腦組織水含量在AP組[（80.39±1.31）%]明顯比正常對照組[（76.51±1.07）]高。但在AP+NAC注射組腦組織水含量明顯比AP組的低[（78.09±1.53）%]

2.2 腦組織TNF-α含量

AP組腦組織TNF-α含量1927.23±326.70 pg/mL明顯比正常對照組221.92±53.91 pg/mL高。但是AP+NAC組與AP組相比，明顯降 低，為（840.14±251.26）pg/mL。

2.3 腦組織丙二醛（MDA）含量

AP組腦組織MDA含量1.26±0.06 nmol/mL明顯比正常對照組0.71±0.02 nmol/mL高。但是AP+NAC組與AP組相比，明顯降低，為（0.93±0.05）nmol/mL。

2.4 微血管內(nèi)白細(xì)胞聚集附壁數(shù)目

與正常對照組（5.3±0.7）相比，AP組（72.5±3.8）白細(xì)胞數(shù)明顯升高，但AP+NAC組（42.4±5.7）白細(xì)胞數(shù)與AP組相比明顯減少。

表1 腦組織含水量、TNF-α、MDA含量、白細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

2.5 腦組織形態(tài)學(xué)檢查

取大鼠腦組織切片，透視電鏡下可見組1大鼠腦細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)正常，無病變。（圖1）

組2大鼠神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯的邊集現(xiàn)象及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均出現(xiàn)不同程度的變性（圖2）。

組3大鼠腦細(xì)胞線粒體有輕度腫脹，細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無異常（圖3）。

圖1

圖2

圖3

3 討論

NAC作為一種抗氧化劑，能使細(xì)胞內(nèi)還原型的谷胱甘肽以及過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的含量升高，抑制TNF-α的釋放，具有保護(hù)細(xì)胞的作用。許多研究表明，炎癥反應(yīng)在腦缺血神經(jīng)元損傷中有重要作用，Carroll等研究大鼠中動脈閉塞模型缺血再灌注時，發(fā)現(xiàn)用NAC治療可縮小大腦梗塞區(qū)體積。但建新等[3]研究也表明，NAC可以抑制TNF-α的表達(dá)，保護(hù)腦細(xì)胞。在海馬等富含多不飽和酸的神經(jīng)組織中，容易受到自由基的攻擊而損傷。劉輝國等[4]發(fā)現(xiàn)NAC可以通過降低海馬組織MDA的含量，以此降低了氧化應(yīng)激反應(yīng)。主動脈壁細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）在體內(nèi)有較為廣泛的分布，但主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞。ICAM-1是一類介導(dǎo)細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間黏附的糖蛋白，劉永剛等[4]在研究中發(fā)現(xiàn)，在腦缺血中用NAC干預(yù)后ICAM-1表達(dá)減少。另外秦文等[5]研究表明NAC可以增加星形膠質(zhì)細(xì)胞能量供應(yīng)，改善細(xì)胞能量代謝障礙，減輕細(xì)胞的損傷。

PE時白細(xì)胞激活，耗氧量增加，并且產(chǎn)生大量的自由基，MDA是脂質(zhì)過氧化物中的主要代謝產(chǎn)物，對細(xì)胞有損傷作用。此外，很多研究證實TNF-α含量明顯升高[6]，TNF-α是天然免疫和特異性免疫的重要細(xì)胞因子，含量過高時可導(dǎo)致炎性損害，在重癥胰腺炎中參與介導(dǎo)腦組織的損傷。

本研究基于這些背景，旨在探討NAC干預(yù)急性胰腺炎時腦損傷的發(fā)生和發(fā)展過程中的腦保護(hù)作用。我們在制作AP模型的當(dāng)天給予注射NAC，目的是發(fā)揮NAC的早期干預(yù)作用，連續(xù)注射是發(fā)揮NAC干預(yù)PE的發(fā)展過程，我們發(fā)現(xiàn)，在NAC的干預(yù)下，腦組織含水量、腦組織TNF-α和MDA含量以及白細(xì)胞聚集附壁數(shù)量與AP未做任何處理組均降低。所有結(jié)果表明NAC對大鼠AP時的腦損傷有明顯的腦保護(hù)作用。

[1]許永春,李兆申,屠振興,等.改良逆行胰膽管注射法制備輕重不同兩種大鼠急性胰腺炎模型[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2004,25(11):1 251-1 252.

[2]孔 雷,韓天權(quán),于穎彥,等.大鼠側(cè)腦室注射細(xì)胞因子對腦損傷的形態(tài)學(xué)研究[J].外科理論與實踐,2006,10(1):51-52.

[3]但建新,秦 龍,陳 煉,等.N-乙酰半胱氨酸預(yù)防大鼠腦缺血再灌注損傷的實驗研究[J].2006,35(5):521-524.

[4]劉輝國,張志鋒,高永平,等.N-乙酰半胱氨酸對慢性間歇缺氧大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及氧化應(yīng)激的影響[J].中國病理生理雜志,2008,20(1):39-40.

[5]秦 文,張曉俠,劉 萍,等.N-乙酰半胱氨酸對糖氧剝奪大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用[J].山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2008,46(9):859-862.

[6]趙海平,呂飛飛,歐陽曉暉.丙二醛/超氧化物歧化酶及腫瘤壞死因子-α在大鼠實驗性胰性腦病中的作用[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2008,15(5):337-341.