銀花泌炎靈片對產ESBLs大腸埃希菌體外抑菌活性研究

王槐棟，胡 亞，張曉天，王冀邯，黃紅蘭，王 放，倪朝輝

（吉林大學白求恩醫學院，吉林 長春 130021）

近年來，由于抗菌藥物的廣泛使用致耐藥性細菌的種類和數量不斷產生、增加[1]。超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）為革蘭陰性菌產生的能使第三代頭孢菌素及單環內酰胺類抗菌藥物分解失效的酶，是造成細菌耐藥性上升的重要原因。耐藥菌株的代表為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌[2-3]。耐藥菌株的出現使臨床抗感染治療面臨新的難題，因此尋找更有效的藥物和治療方法迫在眉睫[4]。中成藥銀花泌炎靈片臨床應用證明具有良好的治療急性尿路感染、急性腎盂腎炎、慢性前列腺炎的作用[5-7]。但該藥對產ESBLs的大腸埃希菌是否有明確療效尚未見報道。因此本文就銀花泌炎靈片對產ESBLs大腸埃希菌的體外抑菌活性進行研究，為臨床應用抗菌中藥制劑治療產ESBLs大腸埃希菌引起的感染提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

生物安全柜（AIRTECH BHC-1300ⅡA/B）、紫外分光光度計（UNIC UV-2800AH）。VITEK-32型全自動微生物鑒定儀（法國生物-梅里埃公司）。

1.2 藥品與試劑

藥敏紙片（英國Oxiod公司），銀花泌炎靈片（吉林華康藥業股份有限公司，批號：101215規格05g×24s/盒），雙黃連膠囊（河北奧星集團藥業有限公司），營養瓊脂（北京雙旋微生物培養基制品廠，批號：20050110）。

1.3 菌株來源

質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922（不產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌）和大腸埃希菌ATCC35218（產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌）。40株大腸埃希菌臨床株分離自臨床住院患者，并經全自動微生物鑒定系統鑒定確認。參照臨床和實驗室標準研究所CLSI2009版推薦的方法進行產ESBLs菌株的初篩及確認，其中18株確定為產ESBLs大腸埃希菌。

1.4 藥敏試驗

所有產ESBLs菌株采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，參照CLSI2009 版標準判定敏感、耐藥和中介。

1.5 銀花泌炎靈片體外抑菌試驗

采用2倍平板稀釋法測定銀花泌炎靈片制劑的最小抑菌濃度（MIC）。制備含待測藥物的營養瓊脂平板，藥物終濃度分別為25、50、100、200、400 mg/mL。復蘇菌株，并在MH肉湯中進行增菌培養，紫外分光光度計在波長為600 nm的條件下將MH肉湯中菌液的OD值調整到0.1～0.2之間，菌液濃度為108/mL。取100 μL菌液滴加在不同藥物濃度的培養皿和空白培養皿上，37℃孵箱孵育過夜。完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為被檢菌的最低抑菌濃度（MIC），分別檢測銀花泌炎靈片對18株產ESBLs大腸埃希菌、對照組大腸埃希菌ATCC25922和大腸埃希菌ATCC35218的MIC。

1.6 統計學分析

所有數據用SPSS 11.5軟件進行統計分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏實驗結果

40株大腸埃希菌臨床分離株中檢出產ESBLs菌株為18株（45.0%），藥敏試驗結果顯示18株產ESBLs大腸埃希菌全部為多重耐藥菌株，除對亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸及頭孢西丁尚較敏感外（耐藥率均低于30%），對其他臨床常用抗菌藥物如頭孢呋辛、頭孢克洛、復方新諾明、左氧氟沙星、慶大霉素、環丙沙星、頭孢曲松等耐藥率均超過70%，對氨芐西林和頭孢唑啉的耐藥率達到100%。結果見表1。

表1 18株產ESBLs大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物耐藥情況（例，%）

2.2 銀花泌炎靈片的抑菌活性

銀花泌炎靈片對18株產ESBLs大腸埃希菌臨床株及質控菌對照株ATCC25922和ATCC35218的MIC范圍均在100 mg/mL-200 mg/mL之間，各組別抑菌活性差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

細菌耐藥性已成為嚴重的醫學和生態學問題，濫用抗生素與其直接相關[8]。本研究從40株大腸埃希菌臨床分離株中鑒定出18株產ESBLs的大腸埃希菌，且它們對臨床一線用藥如：氨芐西林、頭孢唑啉、哌拉西林、頭孢呋辛酯、復方新諾明、頭孢克洛、左旋氧氟沙星、慶大霉素、環丙沙星、頭孢曲松等都產生了超過80%的耐藥情況。ESBLs是絲氨酸蛋白酶的衍生物，它的出現是由于β-內酰胺酶上1～4位點氨基酸發生了突變，可以通過質粒傳播。在臨床分離的菌株中，由質粒介導的耐藥比由染色體介導的耐藥多，它可在不同菌株、菌種或菌屬間轉移擴散。突變產生的ESBLs抗藥譜擴大，且在ESBLs的質粒上常攜帶對其他抗生素如氨基糖苷類及氟喹諾酮類的耐藥基因，故呈多重耐藥性[9-10]。西藥存在副作用、價格高等問題，使用受到限制，尋找并研制對耐藥菌具有抗菌作用的中藥具有重大意義。

在對抗生素耐藥日益嚴重的今天，中藥抑菌的重要作用被人們越來越關注。金銀花具有較強的廣譜抗菌作用[11]；半枝蓮揮發油有一定抑菌作用，而且對革蘭氏陽性菌G+菌的抑菌效果強于對革蘭氏陰性菌G-菌的抑菌效果[12]。根據美國學者ZhaoX和Kari Drlica的突變選擇窗理論，減少細菌突變菌株選擇性富集，防止耐藥發生的方法有：（1）選擇低防突變濃度，窄突變選擇窗濃度的藥物；（2）使抗菌藥物濃度快速達到防突變濃度之上，減少藥物濃度落入突變選擇窗內的時間，但是這種方法可選擇的藥物有限，大多數抗菌藥物的防突變濃度比較高，增大藥物劑量則可能增加藥物的不良反應。（3）通過聯合使用抗菌藥物，降低藥物的防突變濃度縮小突變選擇窗[13]。而中藥正是因為其含有多種相互作用的化合物，對細菌的繁殖起到影響，使細菌不能針對某一種抑菌機制產生抑制作用從而對某種藥物產生耐藥性。

本研究中的銀花泌炎靈片是以傳統中醫藥理論為基礎，以地道中藥材為原料，采用現代先進工藝精制加工而制成的純中藥制劑。銀花泌炎靈片由金銀花、半枝蓮、萹蓄、淡竹葉、燈心草、石韋、桑寄生等十味中藥材組成，具有清熱解毒、利濕通淋之功效，臨床主要用于急性腎盂腎炎，急性膀胱炎等癥。文獻報道其具有良好的治療急性尿路感染、急性腎盂腎炎、慢性前列腺炎等[6-7]等作用。

有報道稱中藥可以使耐藥的大腸埃希菌失去耐藥性，其逆轉程度和藥物濃度及培養時間有關[14]。所以用中藥代替抗生素治療耐藥菌株感染為一種值得推廣的方法。本實驗研究結果表明臨床常用抗生素廣泛耐藥的產β-內酰胺酶大腸埃希菌對中藥制劑銀花泌炎靈片并不產生明顯的耐藥性。說明中藥制劑的抑菌機制與化學抗菌藥物不同，且不受細菌耐藥質粒及耐藥基因的影響。因此，利用抗菌中藥解決產ESBLs大腸埃希菌的耐藥問題，可為臨床應用抗菌中藥治療產ESBLs大腸埃希菌感染提供實驗依據。

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