四種中藥對感染牙本質小管糞腸球菌的抑制作用

于靜 胡永權 王貴花 戴東曉 李君如 謝景朝 王榮霞 趙發銀

糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.faecalis）常見于口腔內科根管治療失敗的再感染根管中。根 管 治 療 后 疾 病 （post－treatment endodontic disease，PED）患牙根管中糞腸球菌的感染率各學者的報道不一［1－4］，但均認為PED患牙根管中糞腸球菌為優勢菌。目前，臨床常用的根管消毒藥物在使用中或多或少存有欠缺，因此，需要尋找一種安全有效的根管消毒藥物來殺滅牙本質小管內糞腸球菌。中藥具有獨特的消炎、殺菌和解毒等功效，且毒副作用小。本實驗選用黃連、五味子、大黃、連翹的水煎劑分別作為試驗藥物，以臨床常用的根管消毒藥甲醛甲酚 （formocresol，FC）作對照，在新鮮的離體人牙上觀察其對糞腸球菌的抑制作用，以期對四種中藥的抗糞腸球菌性能作初步評價，為臨床進一步研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃連、五味子、大黃、連翹水煎劑［四種中藥飲片各50g分別加500ml水，浸泡并經兩次熬制濃縮成50ml，高壓滅菌得每毫升相當于原藥材1g（1∶1）的中藥水煎劑，待冷卻后置于4℃冰箱備用］。甲醛甲酚（FC）（武漢大學口腔醫學院口腔藥物材料廠，批號100525）。無菌生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號：101227407）。普通血瓊脂培養基（90mm，鄭州安圖綠科生物工程有限公司）。

1.2 實驗設備

電子分析天平（MA240D型，上海第二天平儀器廠）；全自動立式蒸汽滅菌器（Model LS－B75L－Ⅱ，江陰濱江醫療設備有限公司）；電熱恒溫培養箱（山東省濰坊醫療器械廠）；數字顯示比濁儀（100%T，上海復星佰珞生物技術有限公司）；一次性使用細菌培養皿（直徑為90mm，江蘇康健醫療用品有限公司）；生物顯微鏡（OLYMPUS－212，日本奧林巴斯儀器公司）；15＃－40＃H型根管銼（MANI.日本）。

1.3 實驗菌種

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）臨床菌株1株，石家莊市第二醫院細菌室提供。

1.4 實驗標本及分組

選擇因正畸治療拔除的新鮮單根管牙84顆，冷凍－20℃冰箱內保存備用。排除牙體齲壞及髓或牙根面齲者、牙根不完整或牙根未發育完全，根尖孔未完全形成或敞開及牙根表面存在細小裂紋者。84顆離體牙分別編號，根據隨機數字表依次將牙齒分入陰性對照組、甲醛甲酚組、黃連水煎劑組、五味子水煎劑組、大黃水煎劑組、連翹水煎劑組、陽性對照組，共為7組，每組12顆。見表1。

表1 7組牙根根管的處理情況

1.5 實驗方法

1.5.1 牙齒預備 將84顆離體牙浸泡于5.25%NaCl 0溶液，24小時后常規開髓、揭頂、去冠髓、拔髓，采取逐步后退法預備根管致40＃大小，配以5.25%NaCl 0溶液與17%EDTA溶液交替沖洗及超聲蕩洗。用高速金剛砂車針去除牙齒冠部及根尖部，留取6mm高的柱狀牙根。將制備好的牙根置于含有25ml牛心腦浸液（BHI肉湯）的試管中，121℃高溫、高壓下滅菌15分鐘，置于5%CO2培養箱（37℃）內，24小時后觀察BHI肉湯無渾濁，以確定滅菌完全。

1.5.2 制備標準菌液 復蘇并鑒定糞腸球菌，將其接種于BHI肉湯中，用比濁儀調整濁度為0.5M（透光度為80%T）的標準菌液備用。

1.5.3 建立根管感染模型 將72顆牙根置于已制備的含糞腸球菌的菌液中，置于5%CO2培養箱（37℃）內培養（以利于糞腸球菌感染根管）。24小時后取出各牙根，用無菌生理鹽水蕩洗根管，無菌吸潮紙尖干燥根管，用蠟將牙根固定于一次性細菌培養皿的底部（注意底部根管口封閉完全）。

1.5.4 放置根管消毒劑及檢測消毒效果 用一次性無菌注射器將藥劑按分組方法輸送至每顆牙根的根管內（見表1）。將放置牙根的各組培養皿置于5%CO2培養箱（37℃）內培養，至第3天時每組各取出6顆牙根，去除根管內試驗藥物，用無菌生理鹽水沖洗、無菌吸潮紙尖干燥后用慢速G鉆均勻磨取根管內層牙本質粉末，用電子天平稱取4mg，置于含有20ml BHI肉湯的無菌試管內，5%CO2培養箱（37℃）內培養72小時后取試管內上層液體，比濁儀測量上層液體的透光度，并記錄數據。培養至第7天時取出每組剩余6顆牙根，作上述處理及檢測。透光度數值接近陰性對照者，證明其抑菌效果好；反之接近陽性對照者，其抑菌效果較差。在測量透光度的同時，各組分別取少量上層液體接種于普通血瓊脂培養基上，5%CO2培養箱（37℃）內培養48小時。進行快速革蘭染色，生物顯微鏡下鑒定BHI肉湯試管內細菌的種類。鏡下觀察為G＋球菌，呈橢圓形，符合糞腸球菌鏡下形態，無其他細菌生長。證明實驗過程無污染。

1.6 數據分析

使用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析。因各組數據方差不齊且非正態分布，選擇秩和檢驗進行統計分析。P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結果

2.1 細菌培養3天時透光度比較

7組培養物上層液體透光度比較，差別有統計學意義（P＜0.05）。黃連水煎劑組與甲醛甲酚組牙本質小管中殘留細菌量較陽性對照組均明顯減少，差別有統計學意義（P＜0.05）；兩者殘留的細菌量最少，差別無統計學意義（P＞0.05）；連翹水煎劑組與陽性對照組比較差別無統計學意義（P＞0.05）；其余各組間差別均有統計學意義（P＜0.05）（見表2）。

2.2 細菌培養7天時透光度比較

7組培養物上層液體透光度比較，差別有統計學意義（P＜0.05）。黃連水煎劑組與甲醛甲酚組比較差別無統計學意義（P＞0.05），該兩組與陰性對照組差別有統計學意義（P＜0.05），但數值很接近；與陽性對照組有差別且有統計學意義（P＜0.05）；連翹水煎劑組與陽性對照組比較差別無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組根管不同處理方法抑菌效果比較（±s，﹪）

表2 各組根管不同處理方法抑菌效果比較（±s，﹪）

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3 討論

糞腸球菌多存在于根管充填完善但仍有持續根尖損害的根管中，是導致根管治療失敗的主要病原菌。本研究參考Haapasalo及?rstavik的實驗方法［5］將糞腸球菌植入離體牙根管內，并模擬口腔溫度及厭氧環境進行培養，制備感染根管內牙本質小管的體外模型，觀察臨床常用根管消毒藥物及四種中藥的抑菌效果。本實驗能比較準確的模擬口腔內環境，比較直觀的反映實際情況，所得結果可信且具有一定的臨床指導意義。

根管治療步驟包括根管預備、消毒和充填，有研究發現根管經過預備后，雖然根管內細菌的數量明顯減少［6］，卻不能完全被殺滅。由此可見應用有效的藥物消毒是很有必要的。而藥物消毒的效果則主要取決于根管消毒劑。因此，本實驗選用臨床常用并公認消毒效果較好的甲酫甲酚作為對照組，觀察黃連、五味子、大黃、連翹水煎劑對離體人牙根管內糞腸球菌的抑菌效果，使實驗結果更直觀、更具說服力。

為了更精確地反映中藥的抑菌作用 ，筆者還選擇了對腸球菌的體外抗菌活性檢測有較好的抑菌效果［7－9］的六種中藥（黃連、五味子、大黃、連翹、烏梅、黃芩），應用M－H瓊脂進行了六種中藥對糞腸球菌抑菌活性的檢測，并選出其中抑菌效果較好的中藥黃連、五味子、大黃、連翹進行了對感染牙本質小管糞腸球菌的抑菌實驗。實驗結果顯示黃連水煎劑對糞腸球菌的抑菌作用優于其他參試中藥，其抑菌效果與甲酫甲酚無差別，考慮與黃連的主要抑菌成分黃連素（小檗堿）有關。黃連素具有廣譜抗菌作用，低濃度抑菌，高濃度殺菌。其作用機制可能是：（1）破壞細菌結構；（2）抑制細菌糖代謝，黃連能抑制酵母菌及細菌糖代謝的中間環節丙酮酸的氧化脫羧過程；（3）抑制核酸、蛋白質合成。兩種實驗結果的一致性進一步證明了黃連有很好的抑制糞腸球菌作用，具備成為新的根管消毒藥物的潛能。且中藥水煎劑制備相對簡便，毒副作用小，不易產生耐藥性，因此進一步將其用于臨床是十分經濟和安全有效的。

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