補腎解毒活血法對骨髓抑制小鼠造血功能的影響

趙靜梅 楊旭輝 王廣占 竇永起

化療是惡性腫瘤治療的主要手段之一，但由于化療引起的骨髓抑制限制了化療用藥劑量和治療節奏，影響了治療效果，并容易引起嚴重感染、出血等并發癥，嚴重影響患者生存質量并威脅患者生命。近年來出現的各種細胞集落刺激因子，雖然具有見效快、有效率高、應用普遍等優點，但費用高昂、副作用多、效果不持久。中醫學多將化療后骨髓抑制歸于脾腎兩虛、氣血不足［1，2］，臨床多以益氣補血為主要的治療方法，但療效還不盡理想。筆者在多年臨床實踐中體會到在補腎基礎上配合解毒活血藥效果會更好，但其作用機制不明，相關的實驗研究也罕有報道。本實驗觀察了補腎解毒活血法對環磷酰胺誘發骨髓抑制的影響，并對其作用機理作了初步探討。

1 材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重18～22g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，常規飼養，動物合格證號：SCXK（軍）2007－004，生產條件許可證：SYXK（軍）2007－004。

1.2 主要試劑與儀器

MethoCult?03534培 養 基 和 MethoCult?03334培養基（加拿大StemCell Technologies公司）；電熱恒溫培養箱：DH4000A（天津泰斯特）；超凈工作臺（北京昌平空氣凈化公司）；Napco－5410 CO2細胞培養箱（shelden公司）；光學顯微鏡OLYMPUS（日本）；Sysmex－820自動血細胞計數儀（日本）；注射用環磷酰胺，產品批號10012621，規格0.2g（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）。

1.3 中藥

補腎解毒活血中藥由熟地10g、何首烏10g、肉蓯蓉10g、苦參10g、白花蛇舌草10g、川芎15g、當歸10g、丹參15g組成，共計90g／d。按《中藥藥理研究方法學》［3］計算小鼠的等效劑量為0.36g·kg－1·d－1。以上藥物均由解放軍總醫院中藥房提供，經鑒定后，水煎、過濾、濃縮、配制成含生藥1g／ml的藥液，置4℃保存備用。

2 方法

2.1 模型制作

小鼠常規飼養3天適應環境后，觀察無異常者，于次日按100mg／kg劑量腹腔注射環磷酰胺，連續3天，制成骨髓抑制模型小鼠。

2.2 分組與給藥

實驗分空白對照組、模型組、中藥治療組。造模完成后次日開始灌胃給藥，中藥治療組給予補腎解毒活血中藥湯液，空白對照組和模型組分別給予等體積的生理鹽水，連續10天。

2.3 外周血細胞分析

每組隨機抽取10只，于造模前1天及造模后第1、3、5、7、10、14 天，每 只 實 驗 小 鼠 尾 靜 脈 取 血20μl，用Sysmex－820自動血細胞計數儀檢測外周血細胞。

2.4 骨髓有核細胞計數及造血祖細胞培養

制模后第11天，頸椎脫臼處死小鼠，剝取股骨，用6號針頭以PBS沖出骨髓細胞，再用4號針頭過濾制成單個骨髓細胞懸液，在顯微鏡下按白細胞計數法進行骨髓有核細胞計數。按文獻方法［4］進行集落培養，檢測小鼠骨髓粒細胞－巨噬細胞集落生成單位（CFU－GM）、紅細胞爆裂型集落生成單位（BFU－E）、定向體外紅系集落形成單位（CFU－E）的生成能力。

2.5 統計學處理

運用SPSS 17.0統計學軟件統計，各組實驗數據以均值±標準差（±s）表示。組間的差異顯著性分析用F檢驗。

3 結果

3.1 補腎解毒活血湯對血虛小鼠外周血象的影響

外周血白細胞（WBC），模型組在造模后第1天降到最低點，與空白對照組相比差異有非常顯著性意義（P＜0.01），造模后第3天仍低于空白對照組，至第5天恢復正常，但在第7天時出現明顯高于正常組的“反跳”現象，而中藥治療組在造模后第3天雖低于空白對照組（P＜0.01），但明顯高于模型組（P＜0.01），第5天恢復正常且保持穩定。見表1。

外周血血小板（PLT），模型組在造模后第5天降到最低然后回升，至第10天達到正常，而中藥治療組自第3天即開始回升，第7天時即與空白對照組持平，且其最低值明顯高于模型組（P＜0.01）。見表2。

各組紅細胞變化不明顯，故省略表。

3.2 補腎解毒活血法對骨髓抑制小鼠骨髓有核細胞計數和造血祖細胞集落的影響

結果顯示模型組小鼠BMNC和CFU－GM、CFU－E、BFU－E計數較空白對照組均明顯減少（P＜0.01），經補腎解毒活血中藥湯液治療后，小鼠BMNC計數和 CFU－GM、CFU－E、BFU－E較模型組明顯增多（P＜0.01）。

4 討論

機體造血主要依靠造血祖細胞來擴增。造血祖細胞在多種造血因子的調控下進一步增殖分化 ，不斷發育形成各種成熟血細胞［5］。當受到化學藥物等損傷時，即會發生造血功能障礙，其主要原因之一是殺傷了賴以維持造血功能的造血干／祖細胞［6］，這是化療藥引起骨髓造血功能下降及外周血細胞減少的主要原因。各種血細胞對化療藥物的敏感性取決于它們的半衰期長短［7］。白細胞半衰期最短6小時，故最易受到抑制，引起白細胞減少；血小板半衰期為5～7天，亦較易引起減少；而紅細胞半衰期長達120天，因此紅系祖細胞數目減少常不易從外周血紅細胞中表現出來。

表1 補腎解毒活血法對環磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血WBC的影響（±s，n＝10，109／L）

表1 補腎解毒活血法對環磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血WBC的影響（±s，n＝10，109／L）

注：與空白對照組比較aP＜0.05，b P＜0.01；與模型組比較c P＜0.05，d P＜0.01。

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表2 補腎解毒活血法對環磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血PLT的影響（±s，n＝10，109／L）

表2 補腎解毒活血法對環磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血PLT的影響（±s，n＝10，109／L）

注：與空白對照組比較aP＜0.05，b P＜0.01；與模型組比較c P＜0.05，d P＜0.01。

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表3 補腎解毒活血法對造血祖細胞集落形成及骨髓有核細胞計數的影響（±s，n＝10）

表3 補腎解毒活血法對造血祖細胞集落形成及骨髓有核細胞計數的影響（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較aP＜0.05，b P＜0.01；與模型組比較c P＜0.05，d P＜0.01。

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中醫學認為血液的生成與心、脾、腎等多臟腑有關，其中與腎的關系最為密切。因腎藏精，主骨生髓，精髓化生血液。即《景岳全書》中“腎為水臟，主藏精而化血”。《張氏醫通》中亦有“血之源頭出于腎”之說。因此補腎法是臨床常用的治療化療后骨髓抑制的方法。但臨床上單用補腎法治療常難以獲得預期療效，結合該病的臨床表現和臨床治療經驗，筆者認為化療藥物為熱毒之品，邪毒內侵，熱毒內蘊，瘀阻骨髓脈絡，導致氣血瘀滯，因此在補腎法的基礎上結合解毒和活血法治療本病，才能達到邪去而元氣自復，瘀去而氣血暢通的效果。方中熟地甘溫，補血養陰，填精益髓，善補腎陰，為補腎陰之要藥，《本草綱目》稱其能“填骨髓，長肌肉，生精血，補五臟內傷不足”，何首烏補肝腎、益精血，治血虛萎黃。《本草綱目》謂其能養血益肝、固精益腎。肉蓯蓉甘溫助陽，為補腎陽、益精血之良藥，三藥平補腎之陰陽，藥性平和，為補腎之良藥。苦參苦寒，能清熱燥濕解毒，白花蛇舌草也有較強的清熱解毒作用，清除蘊積于體內的邪熱和毒邪。川芎活血行氣為血中之氣藥，當歸補血活血，丹參活血調經，祛瘀止痛，即“一味丹參散，功同四物湯”。三藥活血化瘀而生新，共同達到治療骨髓抑制的效果。

表1、表2表明，中藥治療組可以促進 WBC的恢復，且相對于模型組來說其恢復過程較穩定；效果更為明顯的是，中藥治療組血小板降低幅度小、持續時間短，因而提示補腎解毒活血法尤其能提高環磷酰胺所致骨髓抑制情況下的血小板再生。表3表明，環磷酰胺可以引起紅系、粒系造血功能的下降，但由于紅細胞半衰期長達120天，本實驗外周血中未出現明顯變化，而補腎解毒活血法可顯著升高BFU－E、CFU－E和 CFU－GM 集落產率，從而促進紅系和粒單系造血能力的恢復。這可能是其治療化療后骨髓抑制的有效環節。

本實驗還發現，該種造模方法動物恢復快，引起的骨髓抑制持續時間短，而由于中藥作用時間長、起效慢，因而難以很好地反映出中藥防治化療后骨髓抑制的比較優勢；另一方面，由于紅細胞半衰期長達120天，本實驗中未出現明顯變化，臨床上反復化療而引起的貧血也未出現，故有必要考慮進一步改進造模方法。

綜上所述，本實驗結果提示補腎解毒活血法治療骨髓抑制可通過增加骨髓造血祖細胞數量，從而促進環磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血 WBC、PLT的穩定恢復。

［1］劉啟華，王旭 .益氣補血湯治療化療后白細胞減少89例療效觀察［J］.中國中醫藥科，2007，14（6）：447.

［2］苗文紅 .補腎健脾法治療腫瘤放化療后骨髓抑制98例［J］.陜西中醫，2000，21（7）：289.

［3］陳奇 .中藥藥理研究方法學［M］.北京：人民衛生出版社，1996：11103.

［4］劉秀珍 .造血祖細胞培養技術實驗手冊［M］.北京：北京出版社，1993：25.

［5］牛泱平，陳小紅，宋必衛，等 .人參二醇、三醇皂苷對小鼠骨髓造血干／祖細胞體外增殖的影響［J］.中國藥理學通報，2004，20（11）：1316－1317.

［6］鄒仲敏，孫慧勤，羅成基.6Gyγ射線照射誘導骨髓造血細胞凋亡［J］.中華放射醫學與防護雜志，1998，18（6）：390－392.

［7］劉新春，程玉峰，李德愛 .實用抗腫瘤藥物治療學［M］.北京：人民衛生出版社，2002：1078.