紅景天苷聯(lián)合HGF對(duì)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用觀察

黃 偉，錢海鑫，苗宗寧，張學(xué)光

(1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215002;2無錫市第三人民醫(yī)院;3蘇州大學(xué))

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有多向分化能力，在特定的培養(yǎng)條件下可以分化為骨、脂肪、軟骨等多種細(xì)胞［1～5］。研究［6，7］發(fā)現(xiàn)，在體外臍血 MSCs 可被誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞，并能合成釋放谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)等。實(shí)驗(yàn)中常用肝細(xì)胞生長因子(HGF)作為誘導(dǎo)劑，但其誘導(dǎo)方向存在多樣性及不確定性，誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞的數(shù)量較少。紅景天苷是中藥紅景天的提取物，常用于肝病的治療，對(duì)肝細(xì)胞再生具有一定作用。2011年12月～2012年5月，我們采用紅景天苷聯(lián)合HGF誘導(dǎo)臍血MSCs向肝樣細(xì)胞分化，觀察二者聯(lián)合應(yīng)用的誘導(dǎo)效果。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍血 MSCs，DMEM/F12(Gibco公司)，多聚甲醛(上?；瘜W(xué)試劑廠)，胰蛋白酶(Sigma公司)，多聚賴氨酸(Nvitrogen公司);紅景天苷(中國藥品生物制品鑒定所)，HGF(Epro Tech公司);肝功能檢測試劑盒(上海化學(xué)試劑廠)，全自動(dòng)生化分析儀(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 取生長狀態(tài)良好的第5代臍血 MSCs［8］，用 0.25% 胰蛋白酶、0.01%EDTA混合液消化;PBS洗滌2遍，離心、收集細(xì)胞，用工作液(DMEM/F12)將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104/mL;以1 mL/孔接種6孔板，培養(yǎng)4 d。取貼壁生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用含5%FBS的DMEM/F12換液。將臍血MSCs隨機(jī)分成4組，A組不處理，B組分別加入5(B1)、10(B2)、20 μmol/L(B3)的紅景天苷 5 μL，C 組分別加入 5(C1)、10(C2)、20 ng/mL(C3)的HGF 5 μL，D 組分別加入 B1+C1(D1)、B2+C2(D2)、B3+C3(D3)的紅景天苷和HGF。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察及肝樣細(xì)胞計(jì)數(shù) 分別于培養(yǎng)第1、7、14、21天，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化;選取3個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)肝樣細(xì)胞(三角形、多角形或類圓形細(xì)胞)的數(shù)量，取平均值。

1.2.3 細(xì)胞上清液中ALT、ALB檢測方法 分別于培養(yǎng)第1、7、14、21 天，取細(xì)胞懸液;以 1 500 r/min離心15 min，毛細(xì)吸管吸取上清液備用。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測上清液中的ALT，以溴甲酚綠法檢測上清液中的ALB。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)變化及肝樣細(xì)胞數(shù)量比較 A組細(xì)胞均呈長梭形，各時(shí)點(diǎn)無明顯變化;B、C、D組第7天梭形細(xì)胞兩端逐漸變短，第14、21天細(xì)胞由長梭形變?yōu)槿切巍⒍嘟切位蝾悎A形的肝樣細(xì)胞。A組各時(shí)點(diǎn)高倍鏡下均未見肝樣細(xì)胞，B、C、D組在第7、14、21天均可見肝樣細(xì)胞(P 均 ＜0.05)，并隨時(shí)間延長而增加(P均＜0.05);D組肝樣細(xì)胞數(shù)量高于同時(shí)點(diǎn)的B、C組(P均＜0.05)，并隨藥物濃度增加而增加。D2、D3與D1比較，P均＜0.05，而D3與 D2比較，P ＞0.05。見表1。

表1 不同時(shí)點(diǎn)各組肝樣細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè)/HP，±s)

表1 不同時(shí)點(diǎn)各組肝樣細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè)/HP，±s)

組別 肝樣細(xì)胞第1天 第7天 第14天 第21天A組0000 B組B1 0 111± 7.6 118± 7.9 135±10.1 B2 0 121± 8.3 128± 8.7 145±11.1 B3 0 119± 7.8 125± 7.9 140±10.6 C組C1 0 102± 7.4 123± 7.6 138±10.2 C2 0 117± 7.6 131± 7.9 144±10.6 C3 0 123± 8.5 127± 8.0 141±10.6 D組D1 0 131± 9.4 145±11.6 160±14.2 D2 0 145±11.4 157±13.6 179±17.2 D3 0 147±11.5 155±13.3 170±16.8

2.2 不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞上清液中ALT、ALB水平比較 A組各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞上清液中均未檢測到ALT、ALB，B、C、D 組第 14、21 天均檢測到 ALT、ALB(P均 ＜0.05)，并隨時(shí)間延長而升高(P均 ＜0.05);D組ALT、ALB水平均高于同時(shí)點(diǎn)的B、C組(P均＜0.05)，且隨作用藥物濃度的增加而升高，D2、D3與D1比較，P 均 ＜0.05，而 D3 與 D2比較，P ＞0.05。見表2。

表2 不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞上清液中ALT、ALB水平比較(±s)

表2 不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞上清液中ALT、ALB水平比較(±s)

組別 ALT(μg/L)ALB(g/L)第1天 第7天 第14天 第21天 第1天 第7天 第14天 第21天A組00000000 B組B1 0 84.5± 8.1 344.7± 8.5 233.8± 9.1 0 0 0.901±0.018 1.956±0.045 B2 0 114.9± 9.1 511.1±13.3 340.9±11.7 0 0 1.361±0.029 2.559±0.060 B3 0 125.1±12.6 491.6±12.3 362.1±10.1 0 0 1.301±0.031 2.541±0.045 C組C1 0 83.5± 7.9 334.9± 8.2 254.2± 8.8 0 0 0.889±0.020 1.972±0.041 C2 0 116.3± 9.6 491.3±11.6 352.6±10.7 0 0 1.371±0.031 2.561±0.054 C3 0 126.8±10.3 492.5±11.8 383.3±11.5 0 0 1.298±0.035 2.531±0.048 D組D1 0 230.7±12.5 947.2±19.9 647.6±13.2 0 0 1.802±0.040 3.967±0.079 D2 0 335.3±12.6 1 266.2±22.7 867.1±12.8 0 0 2.752±0.059 5.271±0.098 D3 0 336.1±12.3 1 167.5±23.2 868.2±14.2 0 0 2.650±0.062 5.302±0.052

3 討論

肝硬化是一種常見的慢性肝病，尤其是晚期肝硬化，保守治療效果欠佳，病死率居高不下。原位肝移植是治療晚期肝硬化比較有效的措施，但因肝源缺乏、費(fèi)用昂貴、移植排斥反應(yīng)及長期應(yīng)用免疫抑制劑引起并發(fā)癥等，限制了其廣泛應(yīng)用。近年來，對(duì)干細(xì)胞的應(yīng)用研究為解決這一問題帶來了新的希望，特別是臍血MSCs在體外經(jīng)誘導(dǎo)可分化成肝樣細(xì)胞，可代替部分甚至全部的肝臟，為細(xì)胞移植治療晚期肝硬化開辟了新的途徑。

在對(duì)細(xì)胞向肝樣細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)的研究過程中，常用的誘導(dǎo)劑是HGF。HGF因最初被發(fā)現(xiàn)可剌激肝細(xì)胞合成DNA而得名，是肝臟發(fā)育及肝再生過程中最基本的細(xì)胞因子［9，10］;同時(shí)HGF是很強(qiáng)的促肝細(xì)胞增殖因子，不僅能刺激肝細(xì)胞的再生，促進(jìn)肝功能恢復(fù)，而且可改善肝纖維化，在損傷因子刺激時(shí)保護(hù)肝細(xì)胞功能［11，12］。HGF是個(gè)多效應(yīng)的生長因子，除了誘導(dǎo)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化外，還能誘導(dǎo)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞、消化道黏膜細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞甚至神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞等方向分化。HGF作用的多效性相應(yīng)降低了干細(xì)胞肝向分化的專一性，從而使我們所得到的肝樣細(xì)胞的數(shù)量低于預(yù)期［13］。

紅景天苷是中藥紅景天的提取物，能清除自由基，抑制氧化應(yīng)激損傷。其在肝臟損傷的臨床治療中有一定的應(yīng)用，對(duì)肝功能具有廣泛而獨(dú)到的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用紅景天苷即可誘導(dǎo)臍血MSCs向肝樣細(xì)胞分化，并在一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。其機(jī)制可能為:①紅景天苷通過阻斷干細(xì)胞膜上的TGFB-Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制了干細(xì)胞向肝星狀細(xì)胞的分化與增殖，保證了干細(xì)胞在向肝樣細(xì)胞分化的確定性。②紅景天苷可明顯上調(diào)肝再生增長因子(ALR)的水平。ALR作為特異的生長因子，能明顯促進(jìn)肝細(xì)胞的再生而不向其他類型的細(xì)胞分化。③有研究報(bào)道，在紅景天苷誘導(dǎo)MSCs肝向分化的實(shí)驗(yàn)中，加入HGFR、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(PI3K)3條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的阻斷劑，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)明顯下降。提示紅景天苷誘導(dǎo)MSCs肝向分化是通過以上3條信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷聯(lián)合HGF可增強(qiáng)臍血MSCs誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞的作用，其機(jī)制可能為紅景天苷抑制了HGF誘導(dǎo)干細(xì)胞向其他方向分化的潛能，從而保證了干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的方向性［15］。

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