瘦素缺乏小鼠椎間盤退變的組織學(xué)觀察

郭 震，李新鋒，戴力揚

椎間盤退變的確切機理并不清楚，目前認(rèn)為是在遺傳易感性、衰老、力學(xué)負(fù)荷及營養(yǎng)供應(yīng)障礙等因素共同作用下逐漸形成的［1］。隨著分子生物學(xué)及分子免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞因子、類激素等對椎間盤退變的作用逐漸被重視起來［2-3］。2007 年，Gruber等［4］發(fā)現(xiàn)人體椎間盤細(xì)胞表達(dá)瘦素;本研究組也發(fā)現(xiàn)人體椎間盤細(xì)胞表達(dá)瘦素及其受體，瘦素對體外培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞有增殖作用［5］。本研究采用HE 染色對比6 月齡的ob/ob 小鼠(瘦素缺乏小鼠)和野生型小鼠(C57BL)椎間盤形態(tài)學(xué);免疫組織化學(xué)檢測兩者椎間盤Ⅱ型膠原、蛋白聚糖表達(dá);定量PCR 檢測椎間盤Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原及蛋白聚糖基因表達(dá)等方面的差異，進(jìn)一步探討瘦素在活體小鼠椎間盤退變中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及其處理

雄性6 月齡野生型小鼠(C57BL 小鼠)及ob/ob小鼠(瘦素缺乏小鼠)各12 只(6 只做組織學(xué)測定，6只做分子生物學(xué)測量)，購自上海斯萊克動物中心。過量麻醉處死，分離腰椎(椎體及其椎間盤)。一部分立即放入多聚甲醛固定液中固定24 h，無菌蒸餾水沖洗后放入EDTA 中脫鈣2 周，經(jīng)不同梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片，以備HE 染色和免疫組化檢測用。另一部分標(biāo)本在顯微鏡下分離椎間盤后放入研缽中的Trizol 中并快速液氮冷凍、充分研磨，放置-80℃冰箱中以備RNA 提取。

1.2 方法

切片光鏡觀察HE 常規(guī)染色。

免疫組織化學(xué)染色 組織切片60℃烤箱過夜，然后脫蠟、不同梯度乙醇脫水、PBS 漂洗3 次后采用本研究組先前報道的方法［5］進(jìn)行免疫組化染色。具體方法為加入95℃、10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液(pH=6)內(nèi)抗原修復(fù)10 min，室溫冷卻。1% H2O2室溫下處理15 min 消除內(nèi)源性過氧化物活性，室溫下5%正常山羊血清孵育30 min 以減少非特異性著色。在4℃用Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、蛋白聚糖(Abcom公司)兔多克隆抗體孵化12 h，徹底清洗(PBS 洗3 次，每次5 min)。加聚合物增強劑，常溫下孵育20 min，徹底清洗。加對應(yīng)的生物素化的羊抗鼠的IgG 聚合物，室溫孵育30 min。徹底清洗。滴加ABC 復(fù)合物室溫30 min，徹底清洗。DABH2O2顯色，而后蒸餾水洗凈，Gill 蘇木精復(fù)染逐級脫水和透明后封片、鏡檢。切片用Olympus BX50 圖片分析系統(tǒng)觀察。

Realtime PCR 實驗方法按課題組先前報道的方法［6］。具體方法為冷凍于-80℃Trizol 中的標(biāo)本經(jīng)充分研磨后按說明書進(jìn)行RNA 提取;使用TaKa-Ra PrimescriptTM RT Reagent Kit (TaKaRa Japan)試劑盒配成10 μL 反應(yīng)體系，按說明書提示進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;Real-time PCR 引物設(shè)計經(jīng)Genebank數(shù)據(jù)庫檢索Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、蛋白聚糖基因基本信息，采用Oligo 4.0 軟件設(shè)計，由上海皓嘉生物公司合成目的基因及內(nèi)參基因(見表1)。Real-time PCR 反應(yīng)采用SYBR Premix Ex Taq(Takara)試劑盒，按試劑盒說明書進(jìn)行擴增，相關(guān)系數(shù)≥0.98。資料分析用RotorGene 6.0 分析軟件。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)采用獨立樣本t 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

顯微鏡檢查野生型小鼠的L4/L5椎間盤及其毗鄰的上下終板顯示纖維環(huán)、終板及髓核結(jié)構(gòu)相對完整、有序;ob/ob小鼠的椎間盤結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，椎間盤高度降低，纖維環(huán)的外圍出現(xiàn)龜裂，局部甚至出現(xiàn)骨贅，失去了完整的椎間盤的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(見圖1)。

表1 Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、蛋白聚糖引物序列Tab.1 Primer sequences of collagen Ⅱ，collagen Ⅹand aggrecan in Real-time PCR

圖1 組織學(xué)分析Fig.1 Histologic findings

2.2 免疫組化觀察

免疫組化檢驗顯示野生型小鼠的Ⅱ型膠原表達(dá)相對強烈，包括椎間盤纖維環(huán)的全層甚至髓核;而ob/ob 小鼠Ⅱ型膠原染色明顯減弱。蛋白聚糖免疫組化檢驗顯示野生型小鼠的椎間盤上下終板染色明顯強烈，而ob/ob 小鼠椎間盤終板無論在鈣化區(qū)還是非鈣化區(qū)蛋白聚糖免疫著色都相對減弱(見圖2)。

2.3 Real-time PCR 檢測結(jié)果

Real-time PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，相對于野生型小鼠，ob/ob 小鼠Ⅱ型膠原的mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)，兩者間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);ob/ob 小鼠蛋白聚糖的mRNA 表達(dá)量明顯下調(diào)，兩者間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);ob/ob 小鼠椎間盤Ⅹ型膠原mRNA 的表達(dá)量明顯上調(diào)，兩者間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，見圖3)。

3 討 論

本研究的目的是評估瘦素對活體小鼠腰椎椎間盤退變的影響。研究結(jié)果提供的形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)及分子生物學(xué)的直接證據(jù)表明與野生型小鼠相比，ob/ob 小鼠椎間盤明顯退變，體內(nèi)瘦素缺乏可能加速小鼠椎間盤的退變。

圖2 免疫組化分析Fig.2 Immunostaining results

圖3 Real-time PCR 檢測Fig.3 Real-time PCR

實驗中的ob/ob小鼠是野生型小鼠的基因突變小鼠，兩者的區(qū)別僅僅是前者基因突變導(dǎo)致瘦素缺乏，而無其他差異。盡管ob/ob 小鼠體重較大，但Griffin 等［7］發(fā)現(xiàn)瘦素缺乏型小鼠盡管體重是正常小鼠的近3 倍，然而其骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生率并未增加，此研究表明單純體重增加并不能增加關(guān)節(jié)軟骨退變。對小鼠膝關(guān)節(jié)(負(fù)重關(guān)節(jié))如此，對于椎間盤這種非負(fù)重關(guān)節(jié)，體重增加更不會對比較結(jié)果產(chǎn)生影響。6月齡小鼠處于中壯年時期，因此選擇對比觀察6 月齡野生型小鼠與ob/ob 小鼠的椎間盤退變的差異可以明確瘦素對小鼠椎間盤退變產(chǎn)生的可能影響。

眾所周知，椎間盤組織由細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和水組成。而細(xì)胞外基質(zhì)主要由抵抗張力的膠原和抵抗壓力的蛋白多糖共同組成。腰椎椎間盤退變的病理生理基礎(chǔ)是椎間盤細(xì)胞基質(zhì)合成和分解代謝的失衡。Cs-Szabo 等［8］發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變時，蛋白多糖及Ⅱ型膠原的基因表達(dá)均下調(diào)。本實驗形態(tài)學(xué)觀察顯示野生型小鼠椎間盤盡管局部產(chǎn)生龜裂，但其纖維環(huán)、終板及髓核結(jié)構(gòu)相對完整、有序;ob/ob 小鼠的椎間盤結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，椎間盤高度降低，纖維環(huán)出現(xiàn)龜裂、局部甚至出現(xiàn)骨贅，失去了完整的椎間盤的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。免疫組化及Real-time PCR 檢測顯示Ⅱ型膠原及蛋白多糖在椎間盤的退變中變化較為敏感，其含量對維持椎間盤的生物力學(xué)有重要影響［8-11］。免疫組化及Real-time PCR 檢測顯示，與野生型小鼠相比，ob/ob 小鼠的椎間盤Ⅱ型膠原、蛋白多糖的mRNA表達(dá)下調(diào)。從蛋白含量到基因表達(dá)都表明6月齡ob/ob 小鼠椎間盤退變明顯。

本實驗形態(tài)學(xué)檢測中發(fā)現(xiàn)ob/ob 小鼠椎間盤局部甚至出現(xiàn)骨贅，于是繼續(xù)檢測了兩者Ⅹ型膠原的基因表達(dá)變化，因為Ⅹ型膠原在軟骨內(nèi)成骨及基質(zhì)鈣化中起重要作用，而且它反映了退變終末期的開始［12-13］。實驗中發(fā)現(xiàn)野生型小鼠Ⅹ型膠原稍有表達(dá)，而ob/ob 小鼠Ⅹ型膠原基因表達(dá)明顯上調(diào)，提示6 月齡ob/ob 小鼠椎間盤局部骨化增加，而異常的局部骨化可能進(jìn)一步影響小鼠椎間盤營養(yǎng)的供應(yīng)，從而進(jìn)一步加重椎間盤的退變。

本研究組發(fā)現(xiàn)人體椎間盤細(xì)胞表達(dá)瘦素及其受體，瘦素對體外培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞有增殖作用［5］。眾所周知，成體生物細(xì)胞增殖的意義在于取代衰老死亡的細(xì)胞，維持個體細(xì)胞數(shù)量的相對平衡和機體的正常功能。機體的創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理修復(fù)等都要依賴細(xì)胞增殖，所以生理狀態(tài)下、可控的細(xì)胞增殖是有益的。資料顯示軟骨細(xì)胞移植是治療椎間盤疾病的可選方式［14-15］，這也證實了細(xì)胞增殖的有益性。Murad 等［16］認(rèn)為瘦素是創(chuàng)傷愈合過程的自分泌或旁分泌調(diào)節(jié)物。Boos 等［17］也發(fā)現(xiàn)椎間盤細(xì)胞的增殖可以對局部龜裂的椎間盤起到創(chuàng)傷修復(fù)的作用。本組研究人員認(rèn)為瘦素在活體小鼠椎間盤內(nèi)可能有利于創(chuàng)傷修復(fù)，從而延緩椎間盤退變;因此瘦素可以被認(rèn)作為防止椎間盤退變的潛在因素。

1994 年Zhang 等［18］發(fā)現(xiàn)并闡明ob 基因的蛋白產(chǎn)物瘦素的分子結(jié)構(gòu)及生理作用后，關(guān)于瘦素的研究不斷深入。Dumond 等［19］的研究證實瘦素在骨關(guān)節(jié)炎的病理生理中起重要作用，瘦素應(yīng)用后可刺激IGF-β 和TGF-β 2 種生長因子的表達(dá)。近日Griffin等［7］發(fā)現(xiàn)瘦素缺乏型小鼠盡管體重是正常小鼠的近3 倍，然而其骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生率并未增加。以上文獻(xiàn)表明瘦素在四肢關(guān)節(jié)中可能加速了關(guān)節(jié)軟骨的退變。而Hamrick 等［20］研究表明瘦素缺乏在中軸骨及四肢骨、皮質(zhì)骨和小梁骨產(chǎn)生的效應(yīng)是不同的，瘦素缺乏在中軸骨可使椎體長度增加、皮質(zhì)增厚、密度增高、小梁骨容量增大。本實驗亦顯示瘦素缺乏加速了椎間盤軟骨的退變。對于瘦素在四肢關(guān)節(jié)及中軸關(guān)節(jié)軟骨的影響不同，考慮原因可能是椎間盤和關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)來源不同。關(guān)節(jié)軟骨營養(yǎng)主要來自正常滑液及軟骨內(nèi)緣和最深層的鄰近的血管;椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)則主要依靠穿過軟骨下板、呈血管袢樣終止于終板骨軟骨界面的毛細(xì)血管網(wǎng)。

椎體骺板是位于椎體上下兩端的軟骨終板，隨著骨骼發(fā)育成熟，骺板逐漸退化為透明軟骨板，并通過鈣化的軟骨和椎體骨質(zhì)接合，是椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)的主要途徑，與椎間盤源性疾病密切相關(guān)［21］。在腰椎椎間盤退變的諸多危險因素中，營養(yǎng)障礙等后天因素對椎間盤退變的發(fā)病起著非常重要的作用［22］。近期Rutges 等［23］研究發(fā)現(xiàn)軟骨下骨在椎間盤退變之前已出現(xiàn)明顯退變。可見前者退變致后者營養(yǎng)因素變化而加速后者退變。因此本研究認(rèn)為瘦素可能同時因影響椎體骨質(zhì)代謝，從而進(jìn)一步影響椎間盤的代謝，這也是本課題組進(jìn)一步研究的方向。

［1］Hadjipavlou AG，Tzermiadianos MN，Bogduk N，et al.The pathophysiology of disc degeneration:a critical review［J］.J Bone Joint Surg Br，2008，90(10):1261-1270.

［2］丁文元，李寶俊，海涌，等.前炎癥因子在脊髓型頸椎病發(fā)病早期的表達(dá)［J］.脊柱外科雜志，2006，4(4):219-222.

［3］翁習(xí)生，沈建中，邱貴興，等.退變腰椎間盤組織中堿性成纖維細(xì)胞生長因子的表達(dá)研究［J］.中華骨科雜志，2002，22(1):7-10.

［4］Gruber HE，Ingram JA，Hoelscher GL，et al.Leptin expression by annulus cells in the human intervertebral disc［J］.Spine J ，2007，7(4):437-443.

［5］Zhao CQ，Liu D，Li H，et al.Expression of leptin and its functional receptor on disc cells:contribution to cell proliferation［J］.Spine (Phila Pa 1976)，2008，33(23):E858-E864.

［6］Li H，Jiang LS，Dai LY.High glucose potentiates collagen synthesis and bone morphogenetic protein-2-induced early osteoblast gene expression in rat spinal ligament cells［J］.Endocrinology，2010，151(1):63-74.

［7］Griffin TM，Huebner JL，Kraus VB，et al.Extreme obesity due to impaired leptin signaling in mice does not cause knee osteoarthritis［J］.Arthritis Rheum，2009，60(10)2935-2944.

［8］Cs-Szabo G，Ragasa-San Juan D，et al.Changes in mRNA and protein levels of proteoglycans of the anulus fibrosus and nucleus pulposus during intervertebral disc degeneration［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2002，27(20):2212-2219.

［9］Oegema TR Jr.The role of disc cell heterogeneity in determining disc biochemistry:a speculation［J］.Biochem Soc Trans，2002，30(Pt 6):839-844.

［10］Sive JI，Baird P，Jeziorsk M，et al.Expression of chondrocyte markers by cells of normal and degenerate intervertebral discs［J］.Mol Pathol，2002，55(2):91-97.

［11］Roughley PJ，Alini M，Antoniou J.The role of proteoglycans in aging，degeneration and repair of the intervertebral disc［J］.Biochem Soc Trans，2002，30(Pt 6):869-874.

［12］Grant ME.From collagen chemistry towards cell therapy-a personal journey［J］.Int J Exp Pathol，2007，88(4):203-214.

［13］Xi YM，Hu YG，Lü ZH，et al.Gene expression of collagen types IX and X in the lumbar disc［J］.Chin J Traumatol，2004，7(2):76-80.

［14］Meisel HJ，Ganey T，Hutton WC，et al.Clinical experience in cell-based therapeutics:intervention and outcome［J］.Eur Spine J，2006，15(Suppl 3):S397-405.

［15］Meisel HJ，Siodla V，Ganey T，et al.Clinical experience in cellbased therapeutics:disc chondrocyte transplantation A treatment for degenerated or damaged intervertebral disc［J］.Biomol Eng，2007，24(1):5-21.

［16］Murad A，Nath AK，Cha ST，et al.Leptin is an autocrine/paracrine regulator of wound healing［J］.FASEB J，2003，17(13):1895-1897.

［17］Boos N，Weissbach S，Rohrbach H，et al.Classification of agerelated changes in lumbar intervertebral discs［J］.Spine (Phila Pa 1976)，2002，27(23):2631-2644.

［18］Zhang Y，Pronenca R，Maffei M，et al.Positional cloning of mouse obese gene and its human homologue［J］.Nature，1994，372(6505):425-432.

［19］Dumond H，Presle N，Terlain B，et al.Evidence for a key role of leptin in osteoarthritis［J］.Arthritis Rheum，2003，48(11):3118-3129.

［20］Hamrick M W，Penning C，Newton D，et al.Leptin deficiency produces contrasting phenotypes in bones of the limb and spine［J］.Bone，2004，34(3):376-383.

［21］Freemont AJ.The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain［J］.Rheumatology(Oxford)，2009，48(1):5-10.

［22］Battié MC，Videman T，Lev¨alahti E，et al.Genetic and environmental effects on disc degeneration by phenotype and spinal level:a multivariate twin study［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2008，33(25):2801-2808.

［23］Rutges JP，Jagt van der OP，Oner FC，et al.Micro-CT quantification of subchondral endplate changes in intervertebral disc degeneration［J］.Osteoarthritis Cartilage，2011，19(1):89-95.