電針對子宮內膜異位癥大鼠環氧合酶-2的影響

孔偉光,張春雁,張樹輝,蔣文燕,邴興紅,李連波,陳云飛

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電針對子宮內膜異位癥大鼠環氧合酶-2的影響

孔偉光1,張春雁2,張樹輝2,蔣文燕2,邴興紅2,李連波2,陳云飛2

(1.內蒙古中蒙醫院，內蒙古呼和浩特 010020；2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海 200437)

探討電針對子宮內膜異位癥(endometriosis,EMs)大鼠環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的影響及其預防大鼠EMs的效應機制。建立大鼠EMs模型,隨機分為模型組、電針組、COX-2抑制劑組、P450arom抑制劑組、去卵巢組,并設立假手術組。電針組電針血海、三陰交穴;COX-2抑制劑組采用塞萊西布膠囊生理鹽水混懸液灌胃;P450arom抑制劑組采用阿納曲唑片生理鹽水混懸液灌胃;卵巢去勢組切除雙側卵巢;假手術組和模型組捆綁固定并行生理鹽水灌胃。治療及對照處理2星期和4星期后處死各組大鼠,測量各組大鼠異位囊腫長、寬、高三徑并計算平均值,取異位組織進行組織病理學觀察,并測定血清及組織中COX-2的蛋白水平與組織中COX-2 mRNA的表達水平。異位囊腫三徑平均值的比較,模型組均明顯大于其他各組(均＜0.05),電針組明顯小于模型組(＜0.05),且比較4星期與2星期電針組可見其生長較緩慢,異位內膜趨于萎縮,部分上皮細胞壞死;電針組血清中COX-2水平、異位內膜組織中COX-2水平及異位內膜組織中COX-2 mRNA表達水平均明顯低于模型組(＜0.05),并隨著療程的延長效果更明顯。電針可能通過調節異常升高的COX-2 mRNA水平,進而影響COX-2蛋白的合成,下調外周血和局部組織中COX-2的表達而預防大鼠EMs的發生與進展。

針刺療法;電針;子宮內膜異位癥;環氧合酶-2;大鼠

子宮內膜異位癥(endometriosis,EMs)是育齡婦女的常見病,多發生在30～45歲的女性,是一種與不孕密切相關的婦科多發病,其發病率呈逐年上升趨勢,Wu等[1]報道內異癥的發病率達15%～20%,在不孕癥患者當中的發病率高達50%。痛經、不孕作為其主要臨床表現,嚴重影響患者生活質量。現已基本形成了內異癥的臨床診治指南,主要是針對疼痛、包塊和不孕的手術(主要是腹腔鏡)、藥物及助孕技術等治療對策[2]。但本病難以根治,術后3年復發率為38%～51%[3],且上述療法均存在缺陷[4],倘若能夠在本病發生的早期予以預防干預,降低內異癥的發病率,其臨床意義將會更大。因此,研究本病的發病機理,探索早期干預的治療手段,防患于未然,是當前婦科學亟待解決的問題之一。中醫學中針灸療法在本病的治療上取得了一定的成效,電針是目前臨床上治療本病的主要手段之一,本研究即采用電針療法作用于EMs大鼠模型,對電針預防大鼠EMs的效應及其可能的機制進行了有益探索,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院實驗動物中心[SYXK(滬)2006-0001]提供,上海市斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2003-0003]生產,健康的清潔級雌性成熟未交配同一動情周期的SD大鼠50只,體重為(200±20)g。

1.2 預防干預用品與藥物

蘇州醫療用品廠有限公司出品的華佗牌無菌針灸針(0.25 mm×25 mm)、G6805-1A型電針治療儀、塞萊西布膠囊(國藥準字J20030098,0.2 g/片,批號BK070711)、阿納曲唑片(進口藥品注冊證號H20050214,1.0 mg/片,批號ET969)、鹽酸氯胺酮注射液(2 mL含0.1 g,批號071223)、生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液,500 mL/瓶,批號080222)。

1.3 儀器設備

BIO-RAD Model 680酶標儀,OLYMPUS-BX51型顯微照相系統,PERKIN ELMER ABI7000型實時熒光定量PCR儀,SIGMA 3K15低溫冷凍離心機。

1.4 試劑

抗大鼠COX-2抗體(abcam:ab23672,Lot.#E 560404,1:40)、相應二抗、抗體稀釋液(北京博奧森生物技術有限公司,Lot.#E080805)、脫蠟修復液(上海復旦臨床病理診斷中心生產,批號200813)、DAB顯色試劑(上海長島生物技術有限公司,批號2008072)、PBS Buffer(Gene Tech,批號230707)、COX-2 ELISA試劑盒(美國ADL公司,批號20071020)、COX-2 mRNA檢測試劑盒(廣州中山大學達安基因公司,批號20081003)等。

1.5 分組與模型制作

將100只大鼠隨機分為假手術組16只、去卵巢組16只、造模組68只,在動情期,造模組參照Jones法[5]進行手術造模,手術在無菌條件下進行,以2%鹽酸氯胺酮(4 mL/kg)腹腔注射麻醉,將大鼠固定于手術板上,腹部剪毛,皮膚常規消毒后,于腹中線恥骨聯合上1 cm處做2～3 cm長的縱行切口,打開腹腔結扎左側子宮局部血管及需切除的子宮段兩端,切下左側子宮角長約1 cm置于生理鹽水中,縱行切開并將子宮內膜與肌層分離,剪成5 mm×5 mm的內膜組織片段,令其表面上皮對著腹壁,用5-0號真絲縫合線縫于腹壁上,分層關閉腹腔。假手術組進行假手術,開腹方法同造模組,用血管鉗夾持牽拉子宮角。去卵巢組進行手術切除雙側卵巢,開腹方法同造模組,切除雙側卵巢。術后常規飼養7 d,模型建立后將造模組再次隨機分為電針組17只、COX-2抑制劑組17只、P450arom抑制劑組17只、模型組17只,共6組。

1.6 治療及對照處理

假手術組、去卵巢組和模型組進行捆綁固定和生理鹽水灌胃,電針組進行捆綁電針和生理鹽水灌胃,藥物組進行捆綁固定和藥物生理鹽水混懸液灌胃。

電針治療具體操作為,捆綁固定后,以毫針刺入單側血海與三陰交穴(取穴方法及大鼠穴位定位,參照文獻[6]),接電針治療儀,采用疏密波,電流強度為0.3～0.6 mA,治療15 min。單側每日1次,次日換另一側穴位,雙側交替治療。

灌胃參照《動物實驗方法學》[7]。生理鹽水灌胃根據大鼠體重,按照10 mL/kg計算灌胃量;藥物生理鹽水混懸液灌胃根據成人藥物劑量換算大鼠等效劑量,塞萊西布5 mg/kg,阿納曲唑0.1 mg/kg,并根據大鼠體重,按照10 mL/kg計算灌胃量,每次灌胃前將配制好的混懸液顛倒混勻。

療程均為每日1次,6 d為1個療程,療程間隔1 d,治療2個療程(2星期)后處死1批,余治療4個療程(4星期)。

1.7 取材與指標檢測

療程結束后,分別于第2星期與第4星期后在動情期將大鼠開腹,腹主動脈采血處死,3000 rpm離心后取血清;觀察子宮、卵巢及異位囊腫的大體形態,并用雙腳圓規和直尺測量異位囊腫長、寬、高三徑,計算平均值;取在位內膜組織和異位內膜組織,部分置于0.8 mL凍存管－80℃保存,部分用10%福爾馬林溶液固定。

1.7.1 ELISA法檢測血清中COX-2分子表達水平

血清中COX-2分子表達水平檢測采用酶聯免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbentassy,ELISA),按照COX-2 ELISA試劑盒說明書操作。

1.7.2 IHC檢測在位與異位內膜組織中COX-2蛋白表達水平

在位內膜與異位內膜組織中COX-2蛋白表達水平檢測采用免疫組織化學法(immunohistochemistry, IHC)。取10%福爾馬林溶液固定組織,脫水,石蠟包埋,5mm連續切片,抗大鼠COX-2抗體濃度1:40,脫蠟修復液熱修復,DAB顯色,蘇木素復染,健康雌性SD大鼠肺臟為陽性對照,用抗體稀釋液代替一抗作為陰性對照。COX-2主要表達于子宮內膜腺上皮細胞及間質細胞的細胞漿中,以胞漿呈棕黃色為陽性。免疫組化陽性計數方法,采用雙盲法,任取連續4個高倍(×400)視野計數陽性細胞個數,然后取平均值,即為該組織切片的陽性細胞數,設定5個評分等級,0為0個,1為1～20個,2為21～40個,3為41～60個,4為＞60個。

1.7.3 FQ-PCR檢測在位與異位內膜組織中COX-2 mRNA表達水平

在位內膜與異位內膜組織中COX-2 mRNA表達水平的檢測采用熒光定量聚合酶鏈反應法(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)。取凍存的異位內膜組織打碎勻漿,用一步法抽提總RNA,PCR擴增由廣州中山大學達安基因公司合成,上游5’-CYYGCTGTTCCCACCCATGT-3’,下游5’-ATCCTGTCCGGGTACAATCG-3’;PCR產物502bp;內參GAPDH引物,上游5’-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3’,下游5’-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3’,PCR產物306bp。總RNA的提取,Trizol提取異位內膜組織總RNA;RT的提取,取4mL RNA樣品(陰性對照為4mL Trizol),加入5×逆轉錄buffer 4mL,上游引物F 0.4mL,下游引物R 0.4mL,dNTPs 0.2mL,逆轉錄酶MMLV 1mL,DEPC水10mL,反應條件為37℃,1 h;PCR的提取,取cDNA產物于50mL反應體系中進行PCR擴增,該反應體系包括5×PCR buffer 10mL,外上游引物F 0.5mL,外下游引物R 0.5ml,dNTPs 0.5mL,熒光探針(避光)0.5mL,Taq酶2mL,ddH2O水31mL。PCR擴增條件為93℃ 2 min,93℃ 45 s 55℃ 1 min 10Cycle,93℃ 45 s,5℃ 1 min 30Cycle。反應在ABI7000型熒光定量PCR儀上進行,數據采用儀器自帶軟件ABI Prism 7000 SDS Software分析。

1.8 統計學方法

各組異位組織三徑平均值、血清與組織中COX-2水平、組織中COX-2 mRNA表達的比較,采用SPSS14.0 One-Way ANOVA統計數據,以＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組異位組織大體觀察

由表1可見,治療及對照處理2星期與4星期后,假手術組未見異位囊腫。2星期后,電針組、COX-2抑制劑組、P450arom抑制劑組大鼠異位囊腫大小與模型組比較,差異均無統計學意義(＞0.05),僅去卵巢組大鼠異位囊腫小于模型組(＜0.05);而4星期后,電針組、COX-2抑制劑組、去卵巢組大鼠異位囊腫大小,較模型組縮小(＜0.05或＜0.01),P450arom抑制劑組大鼠異位囊腫大小與模型組相比較,無統計學差異(＞0.05)。經4星期電針治療后,大鼠異位囊腫大小較2星期時增長幅度較小。

表1 各組大鼠異位囊腫大小比較 (±s,mm)

注:與模型組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與電針組比較3)＜0.05

2.2 各組大鼠血清中COX-2分子表達水平比較

由表2可見,治療及對照處理2星期與4星期后,模型組大鼠血清中COX-2含量與各組比較,差異均具有統計學意義(＜0.05或＜0.01)。經4星期電針治療后,大鼠血清中COX-2含量明顯少于治療2星期后。

表2 各組大鼠血清中COX-2分子表達水平比較 (±s,ng/mL)

注:與模型組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與電針組比較3)＜0.05

2.3 各組大鼠組織中COX-2蛋白表達水平比較

COX-2主要表達于間質細胞的胞漿中,以胞漿中出現明顯的棕色顆粒為陽性細胞,無著色為陰性細胞,由免疫組化結果可見,假手術組子宮內膜及其他各組在位內膜較少或偶有弱表達COX-2陽性細胞,無法納入統計。

表3 各組大鼠異位內膜組織COX-2蛋白表達水平比較 (±s,ng/mL)

注:與模型組比較1)＜0.01

由表3可見,治療及對照處理2星期與4星期后,模型組COX-2的陽性細胞數明顯高于其余各組(＜0.01);電針組、COX-2抑制劑組、P450arom抑制劑組、去卵巢組相比較,差異均無統計學意義(＞0.05)。從均數來看,隨著療程的增加,各治療組的COX-2蛋白含量有不同程度下降,尤以4星期去卵巢組明顯,且與2星期時各組相比較差異均具有統計學意義(＜0.05)。詳見圖1。

治療及對照處理2星期后、4星期后假手術組子宮內膜組織與其他各組異位內膜組織中COX-2蛋白的組織分布與表達情況詳見圖1-圖12,箭頭所指為COX-2陽性表達的間質細胞。

A 2星期假手術組大鼠子宮內膜組織中COX-2蛋白表達;B 4星期假手術組大鼠子宮內膜組織中COX-2蛋白表達;C 2星期模型組大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白表達;D 4星期模型組大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白表達;E 2星期電針組大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白表達;F 4星期電針組大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白表達;G 2星期P450抑制劑組大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白表達;H 4星期P450抑制劑組大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白表達;I 2星期COX-2抑制劑組大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白表達;J 4星期COX-2抑制劑組大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白表達;K 2星期去卵巢組大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白表達;L 4星期去卵巢組大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白表達。IHC×400

2.4 各組大鼠組織中COX-2 mRNA表達水平比較

本實驗中陰性對照擴增結果呈陰性表達,未檢測到目的基因COX-2 mRNA的表達,待測標本檢測到目的基因COX-2 mRNA的表達,對照內參的Ct值,進行統計分析。結果顯示,在位內膜(23.96±0.99)與異位內膜(26.13±1.58)間COX-2 mRNA的表達比較明顯偏低(＜0.05)。

由表4可見,在位內膜間,治療及對照處理2星期與4星期后,模型組明顯高于電針組、COX-2抑制劑組、P450arom抑制劑組、去卵巢組、假手術組(＜0.01)。4星期各組與2星期各組比較可發現各干預組與模型組在位內膜組織中COX-2 mRNA的表達均有不同程度下降,但不具有統計學差異(＞0.05)。異位內膜間,治療及對照處理2星期與4星期后,模型組明顯高于電針組、COX-2抑制劑組、P450arom抑制劑組、去卵巢組(＜0.01);與電針組比較,去卵巢組明顯偏低,且差異具有統計學意義(＜0.05),與其余各組COX-2 mRNA的表達比較不具有統計學差異(＞0.05)。4星期各組與2星期各組比較可發現電針組、COX-2抑制劑組、P450arom抑制劑組和去卵巢組其COX-2 mRNA表達含量有不同程度下降,模型組異位組織中COX-2 mRNA表達4星期后較2星期時表達有所上升,但不具有統計學差異(＞0.05)。

表4 各組大鼠組織中COX-2 mRNA表達水平比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.01

3 討論

子宮內膜異位癥屬中醫學“痛經”、“癥瘕”、“月經不調”、“不孕”范疇,病因病機多責之于血瘀,在治療上取得了一定的成效。針灸是中醫學的一大治療手段,因其應用簡便、對患者刺激較小,多年來廣泛地應用于對本病的治療中。針灸對EMs的療效明顯,多選用血海、三陰交等為治療EMs的主穴,可以活血化瘀,疏經止痛。

本研究選取異位組織長、寬、高三徑的測量結果平均值對效應進行評判,結果證實,經電針治療的EMs大鼠,其異位囊腫生長趨于緩慢,與塞萊西布和阿納曲唑兩藥相比具有相同的預防功效,提示電針與上述兩藥均有抑制異位囊腫生長的效應,這與針灸治療EMs的效應結果相似[8],但目前尚未見EMs的預防治療或電針對其預防作用的相關報道。

EMs的發病機制至今尚未明確,Sampson等[9]于1922年提出的經血逆流子宮內膜種植學說無法解釋80%～90%的婦女存在經血逆流[10],卻只有15%～20%的婦女發生異位癥的臨床現象。近年我國郎景和[11]在國際上首次提出新的EMs病因假說——在位內膜決定論(determinant of uterine eutopic endometrium),引起了國際同行的關注。他認為,在位內膜的差異是發生內異癥的關鍵因素。COX-2能增加細胞的侵襲性,且可誘導血管形成,促進異位內膜細胞的增殖、種植和生長,在內異癥患者的在位內膜中,COX-2的表達明顯升高[12]。

COX-2的過表達導致PGs合成異常,刺激內膜細胞產生P450arom,合成E2,為異位內膜生長提供了激素支持。此外,COX-2還可能參與局部組織血管生成、細胞的增生和抑制免疫監督,促進了異位癥的病理生理過程[13]。目前針對COX-2和P450arom已研制出相應的抑制劑,并已投入臨床與COX-2和P450arom表達異常相關的疾病治療中,如塞萊西布用于拮抗COX-2的表達,從而緩解成人骨關節炎和類風濕關節炎的癥狀和體征;阿納曲唑通過抑制芳香化酶,用于乳腺癌的治療中。

研究表明[14,15],電針可下調COX-2水平的異常升高,推測這可能是電針干預EMs發生的主要環節之一。本研究即從該角度入手,結果表明,模型組大鼠血清、異位內膜組織中COX-2含量較假手術組大鼠血清及正常內膜組織均明顯升高,且在位與異位內膜組織COX-2 mRNA表達均明顯增高,而經電針治療的大鼠,其血清中、異位組織中COX-2含量明顯降低,在位與異位內膜組織COX-2 mRNA表達均明顯降低,與應用COX-2抑制劑和P450arom抑制劑的效應相當,且隨著療程的延長作用更明顯,提示電針可能是通過調節異常升高的COX-2 mRNA水平,進而影響COX-2蛋白的合成,下調外周血和局部組織中COX-2的表達,削弱由COX-2異常表達而引起的細胞侵襲、血管形成及異位內膜細胞的增殖、種植和生長,從而預防大鼠EMs的發生與進展,李傲等[16]運用中藥治療大鼠EMs也取得了類似的效應。

本研究從動物實驗的角度初步探討了電針對大鼠EMs的預防效應及其可能的作用機制,證實電針可能是通過調節異常升高的COX-2 mRNA表達,下調COX-2水平而起到預防大鼠EMs的發生發展的效應,但該過程中尚存在許多相關因素,有待于進一步的研究探討。

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Effect of Electroacupuncture on Cyclooxygenase-2 in Endometriosis Rats

KONG Wei-guang1, ZHANG Chun-yan2, ZHANG Shu-hui2, JIANG Wen-yan2, BING Xing-hong2, LI Lian-bo2, CHEN Yun-fei2.

1. Inner Mongolia Mongolian hospital; 2.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Yueyang Hospital of Combined Traditional Chinese and Western Medicine,Shanghai 200437,China

To investigate the effect of electroacupuncture (EA) on cyclooxygenase-2 (COX-2) in endometriosis (EMs) rats and explore the mechanism of its action in preventing rat EMs.A rat EMs model was maded. The rats were randomly assigned to model, EA, COX-2 inhibitor, P450arom inhibitor, ovariectomy and sham operation groups. The EA group received electroacupuncture at points Xuehai(SP10) and Sanyinjiao(SP6); the COX-2 inhibitor group, an oral gavage of a suspension of Celebrex in normal saline; the P450arom inhibitor group, an oral gavage of a suspension of Anastrozole in normal saline; the ovariectomy group, surgical removal of both ovaries; the sham operation and model groups; binding fixation and an oral gavage of normal saline. All groups of rats were sacrificed after two and four weeks of treatment or control treatment. The length, width and height of the ectopic cyst were determined. An average value was calculated. The ectopic tissue was taken and examined histopathologically. The level of COX-2 in serum and the tissue and the expression of COX-2 mRNA in the tissue were measured.The average values of the three diameters of the ectopic cyst were significantly larger in the model group than in the other groups (all＜0.05) and significantly smaller in the EA group than in the model group (＜0.05). A comparison between two and four weeks in the EA group showed that the ectopic cyst grew slowly, the ectopic inner membrane tended to atrophy and part of the epithelia became necrotic. The level of COX-2 in serum and the ectopic intimal tissue and the expression of COX-2 mRNA in the ectopic intimal tissue were significantly lower in the EA group than in the model group (＜0.05). The effects became more marked as the course of treatment lengthened.Electroacupuncture may prevent the occurrence and development of EMs in rats by regulating abnormally high COX-2 mRNA levels, affecting the synthesis of COX-2 and downregulating the expression of COX-2 in peripheral blood and the local tissues.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Endometriosis; Cyclooxygenase-2; Rats

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.11.847

1005-0957(2012)11-0847-05

上海市衛生局科研項目資助(2008221);上海高校選拔培養優秀青年教師科研專項基金資助(szy08102);上海市重點學科建設項目資助(S30303,S30304)

孔偉光(1984 - ),女,主治醫師

陳云飛(1968 - ),男,研究員,研究方向為針灸免疫研究, E-mail:icyf1968@yahoo.com.cn

2012-05-23