長木蜂蜂糧中微生物豐度及抑菌活性菌株的篩選

賀春玲，張淑霞，嵇保中，劉曙雯

(1.河南科技大學林學院，河南洛陽 471003;2.南京林業大學森林資源與環境學院，南京 210037;3.南京中山陵園管理局，南京 210014)

釀貯蜂糧是膜翅目2萬多種花粉蜂較為普遍的習性。雌蜂筑好巢室后，一次性備足幼蟲一生所需的蜂糧，然后在蜂糧上產卵并封閉巢室，孵化出的幼蟲完全依賴蜂糧為食完成發育 (吳燕如，1965)。蜂糧 (Bee bread)也稱蜂面包、蜂巢花粉，是采粉蜂將花粉團卸落在巢房中，通過咬碎、吐蜜濕潤等行為對花粉團進行初步加工后，在微生物的作用下，封藏的花粉團經過一定時間的發酵所形成的蜂花粉釀制產物 (嵇保中等，2006)。蜂糧中含有豐富的微生物資源，貯備的蜂糧在巢房中有一個復雜的微生物區系變化和生物化學變化過程 (袁耀東，1991;蘇松坤，2000)。Gilliam et al.(1989)從杏仁花粉、蜂花粉和1、3、6周蜂糧樣品中分離到芽孢桿菌屬的6種芽孢桿菌41個菌落和148株霉菌。蘇松坤等 (2001)從中國茶的手采花粉、蜂花粉和不同釀制時間的蜂糧樣品中分離出207個細菌菌落和9個屬131株霉菌。其中蜂糧中的微生物及其代謝產物能有效抑制蜂糧中雜菌的生長，在蜂糧的釀制過程中具有十分重要的作用 (Gilliam et al，1997;蘇松坤，2002)。

長木蜂Xylocopa tranquebarorum屬蜜蜂科Apidae木蜂屬Xylocopa的野生蜂類，與蜜蜂類似，它們采集芍藥 Paeonia lactiflora、虞美人 Papaver rhoeas、槐花Sophora japonica、云實Caesalpinia decapetala、薔薇Rosa spp、女貞Ligustrum lucidum等植物花粉制作蜂糧 (賀春玲等，2009)。羅祿怡(1992)報道長木蜂蜂糧在巢室內能較長時期保持濕潤狀態不會霉變。賀春玲等 (2009)報道長木蜂蜂糧的醇提液 (70%)對枯草芽孢桿菌具有很強的抑制作用。關于長木蜂蜂糧的微生物群落變化規律、在釀制過程中的功能以及蜂糧長期保持的機制等問題國內外未見報道。本文以芍藥花粉的長木蜂蜂糧為研究對象，初步研究長木蜂蜂糧在釀制過程中微生物的變化規律，同時篩選具有抑菌活性的微生物菌株，為揭示蜂糧釀制及長期保存過程中防腐機制和開發新的防腐資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試長木蜂

不同巢室中的越冬雌蜂、釀貯蜂糧盛期的雌蜂及長木蜂的幼蟲和蛹均采集于南京林業大學樹木標本園、南京中山植物園和南京情侶園花卉公園。

1.1.2 樣品的采集

2008年5月芍藥盛花期，在南京情侶園花卉公園采集芍藥花粉、芍藥長木蜂花粉、不同釀制階段的芍藥長木蜂蜂糧樣品。具體的采集方法見賀春玲等 (2010)。

手采芍藥花粉樣品:分為芍藥花未開放前采集的樣品和芍藥花已經開放后的樣品，分別表示為花粉 (1)和花粉 (2)。

芍藥花未開放前樣品采集:在芍藥大蕾期，將花苞采下放入滅菌的采集袋中，帶回實驗室后在無菌操作臺上取出花粉放入滅菌的5 mL離心管中，4℃保存備用。

芍藥花已經開放后樣品的采集:在芍藥大蕾期，用細尼龍網袋套將花蕾罩上，待花開放后用滅菌的鑷子迅速取下花粉，放入滅菌的的5 mL離心管中，低溫帶回實驗室后4℃保存備用。

長木蜂幼蟲蟲糞和長木蜂制作的巢室隔板樣品采集:2008年5月中旬，在南京情侶園花卉公園的芍藥園附近采集捆綁的長木蜂筑巢枯竹，帶回實驗室后，在無菌操作間解剖取出幼蟲的蟲糞和巢室隔板放入滅菌的培養皿內，4℃保存備用。

1.1.3 培養基的配置

牛肉膏蛋白胨培養基 (簡稱NA)、改良LB培養基、改良MRS培養基 (pH4.5、pH6.5)、產芽孢培養基、酵母浸膏麥芽汁培養基、葡萄糖天門冬酰胺培養基和PDA培養基的配置參見周德慶(1986)、凌代文 (1999)、黃秀梨 (1999)、東秀珠等 (2001)、楊潔彬 (1996)的方法進行。本實驗所用試劑均為國產分析純。

1.1.4 指示菌株

測試細菌為金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis;測試真菌為青霉菌Penicillium citrinum、黑曲霉菌Apergillus oryzae、根霉菌Rhizopus、毛霉菌Mucor、假絲酵母Candida sp.和啤酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae;所有菌株均由南京林業大學森林資源與環境學院微生物教研室提供。細菌菌種在牛肉膏蛋白胨固體斜面培養基37℃下培養24 h，真菌菌種在PDA固體斜面培養基28℃下培養48 h，4℃下保存備用。

1.2 方法

1.2.1 長木蜂體表微生物的分離

采集不同時期帶有長木蜂筑巢的枯竹并帶回實驗室，在無菌操作間解剖取出越冬雌蜂、釀貯蜂糧盛期的雌蜂以及幼蟲、預蛹和蛹并稱重，然后分別放入5 mL滅菌離心管中，按照蟲體重量每克加入9 mL的無菌水，記為10－1;按照稀釋涂布分離法的稀釋方法 (周德慶，1986)稀釋至10－3、10－4濃度的稀釋溶液備用。

稀釋到10－3和10－4的稀釋液樣品分別吸取200 μL用涂棒均勻涂布在NA、改良LB培養基、MRS培養基 (pH6.5、pH5.5和pH4.5)平板上，在28℃培養。隨時觀察并記錄菌株的生長情況，統計樣品中的菌落總數，然后用接種針挑取不同形態的菌落移入相應的培養基上純化、培養。每個樣地取不同巢室的蟲態 (越冬雌蜂、釀貯蜂糧盛期的雌蜂以及幼蟲、預蛹和蛹)各3頭，每個樣品重復3次，3次的平均值為該樣品在各種培養基上的菌落數。

1.2.2 長木蜂幼蟲蟲糞和巢室隔板的微生物分離

在無菌操作間稱取幼蟲蟲糞和巢室隔板各0.3000 g于滅菌的10 mL離心管中，用無菌的玻璃棒將蟲糞和巢室隔板搗碎后，加入2.7 mL去離子水，充分搖勻，記為10－1;按照稀釋涂布分離法的稀釋方法 (周德慶，1986)稀釋至 10－3、10－4濃度的稀釋溶液備用。

稀釋到10－3和10－4的稀釋液樣品分別吸取200 μL用涂棒均勻涂布在NA、改良LB培養基、MRS培養基 (pH4.5和pH6.5)平板上，在28℃培養。隨時觀察并記錄菌株的生長情況，統計樣品中的菌落總數，然后用接種針挑取不同形態的菌落移入相應的培養基上純化、培養。每個樣品重復3次，3次的平均值為該樣品在各種培養基上的菌落數。

1.2.3 芍藥花粉、芍藥長木蜂花粉和不同日齡的蜂糧樣品中微生物分離

稱取采集的芍藥花粉、新鮮芍藥長木蜂采集的花粉、1日、2日、3日、……10日、15日、20日、30日芍藥長木蜂蜂糧樣品各0.3000 g于滅菌的10 mL離心管中，加入2.7 mL去離子水，充分搖勻，記為10－1;按照稀釋涂布分離法的稀釋方法 (周德慶，1986)稀釋至10－3、10－4濃度的稀釋溶液備用。微生物分離培養方法同1.2.2。

不同日齡的蜂糧樣品:指長木蜂采集花粉蜜制作蜂糧完成后在蜂糧上產卵開始，記為1日齡，第2天記為2日齡，依此類推3日齡、4日齡……1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 細菌菌落形態鑒定

觀察菌落表面顏色、隆起度、質地、邊緣光滑、粗糙、菌落直徑、干燥度、產芽孢有無和革蘭氏染色。

湖泊水體是OCPs的一個重要匯集地，具有流動性小、水交換周期長、對污染物的稀釋能力弱、生態系統相對較脆弱、生態平衡容易遭到破壞且不容易恢復等特點，所以較其他水環境更容易受到污染［20］。有機氯農藥污染湖泊水體的途徑有地表徑流、大氣沉降和湖底沉積物的二次釋放。

1.2.4.2 放線菌菌落形態鑒定

插片培養法顯微鏡觀察菌絲形態、顏色、質地、分枝、橫隔、孢子著生位置、孢子形狀、顏色、孢子絲形狀、顏色、氣生菌絲、基內菌絲、菌絲顏色、質地、孢子粉顏色、密度等。

1.2.5 抑菌活性菌株的初篩

指示細菌的抑菌活性:采用瓊脂塊法對所分離得到的菌株進行抑菌活性初篩。具體方法為將分離得到的菌株劃線培養與相應的培養基，在28℃培養2～5 d，用打孔器 (Φ=6 mm)將菌落打下并移至含有指示菌的營養瓊脂平板上，然后在28℃培養2～5 d，每個菌株重復3次，觀察其抑菌活性。

指示真菌的抑菌活性:采用平板對峙培養法，將分離到的菌株與指示真菌在PDA平板上進行對峙培養，用打孔器 (Φ=6 mm)將在PDA上活化的指示真菌打成菌柄塊，用接種針移入PDA平板中央，在距中央2 cm處涂分離菌株，27℃恒溫培養，待CK長滿皿時，測其抑菌帶的寬度。每菌株設3皿重復，不接待測菌的為CK。

1.3 數據采集與分析

采用多功能型全自動菌落/顯微圖像分析儀(杭州迅數科技有限公司生產)進行數據采集;采用Microsoft Excel和SPSS Base Ver.13.0統計軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 長木蜂體表微生物分離結果

采用 NA、改良 LB培養基、MRS(pH4.5)、MRS(pH5.5)、MRS(pH6.5)培養基對長木蜂雌蜂釀貯蜂糧盛期體表微生物狀況進行分離，結果見圖1(A)，由圖1(A)表明在5種培養基上分離到的微生物菌落數不同，在MRS4.5的培養基上分離到的菌落數量最多，為21176±5392個/g;在改良LB培養基上分離到得菌落數最少，為2400±1509個/g。通過菌落形態觀察和顯微形態觀察，發現在五種培養基上分離到的微生物主要有細菌、酵母菌和放線菌，其中在MRS培養基上分離到的菌落主要屬于乳酸菌和酵母菌。

圖1 長木蜂雌蜂在不同培養基 (A)和不同階段 (B)體表微生物菌落數量Fig.1 Microorganism colonies on body surface of female in different culture mmedium(A)and in different stages(B)X.tranquebarorum

2.2 長木蜂蜂糧釀制過程中微生物菌落數量變化規律

采用 NA、改良LB培養基、MRS(pH4.5)、MRS(pH6.5)培養基對長木蜂雌蜂釀貯蜂糧過程中蜂糧微生物數量的變化情況進行培養分離 (圖2)。芍藥未開放之前的花粉樣品，在各培養基中均未分離到微生物菌落;在芍藥開花后采集的花粉樣品，在NA培養基上分離到的細菌菌落數量最多，改良LB培養基上分離的菌落數量少，而MRS(4.5)和MRS(6.5)培養基上未分離到菌落;芍藥長木蜂花粉在上述四種培養基上均分離到微生物菌落;長木蜂蜂糧的微生物菌落的變化規律，1日齡蜂糧中菌落數最多，2日齡開始下降，3日齡降至降低點，在4日齡階段微生物的菌落數出現一個低谷，然后升高;8～12日齡又出現一個小高峰，12日齡后，長木蜂蜂糧中微生物基本趨于穩定狀態，由此可知，長木蜂蜂糧在釀制過程中內部的微生物區系發生了很大變化。

2.3 長木蜂蜂糧中分離到的微生物菌株

采用 NA、改良 LB培養基、MRS(4.5)、MRS(6.5)培養基分別對手采芍藥花粉、芍藥長木蜂花粉和不同釀制時間的蜂糧樣品進行微生物分離，根據菌落的顏色、形態、革蘭氏染色以及培養時間的長短和培養基的不同，將分離的菌株進行純化，共分離菌株68株，其中細菌43株，酵母17株，放線菌8株。酵母菌株主要分離自MRS(4.5)和MRS(6.5)上，放線菌菌株主要分離自NA培養基上，蜂糧中的酵母菌主要來自長木蜂雌蜂的體表，雌蜂在釀貯蜂糧過程中添加到蜂糧中。

2.4抑菌活性菌株初篩

2.4.1對指示細菌的抑菌活性

采用瓊脂塊法對分離的68株菌株進行抑菌活性初篩。68株菌株中其中12株對指示細菌有抑制作用 (表1，圖版1)。分離的酵母菌菌株對細菌和真菌均沒有抑菌活性，分離的細菌菌株PT－1、NF－25、NF－26、NF－27、NF－28和NF－33對

圖2 長木蜂蜂糧釀貯過程中微生物數量的變化規律Fig.2 The dynamica changes of the amount of bacterial colonies during the process of brewing bee bread for X.tranquebarorum

指示細菌有明顯的抑制作用，對金黃色葡萄球菌有很好的抑菌活性;NF－11、NF－17、NF－18、NF－19、NF－32、NF－34屬于放線菌，對金黃色葡萄球菌有抑制作用，其中NF－32和NF－34對枯草芽孢桿菌也表現出很好的抑菌活性。

表1 從蜂糧中分離的菌株對指示細菌的抑菌活性Table 1 The antibacterial activity of strains separated form bee bread

2.7.2 對指示真菌的抑菌活性

篩選的68株菌株中，對指示真菌有抑菌活性的有10株 (表3)，抑菌活性較強的有3株，分別為NF－25、NF－32和NF－34，其中NF－34菌株對青霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌均有很好的抑制作用，對啤酒酵母的抑制作用最強，抑菌圈直徑為33.45±2.57mm，但對假絲酵母抑制作用弱 (圖版7－1)。

表2 從蜂糧中分離的菌株對真菌的抑菌活性Table 2 The antibacterial activity of strains separated form bee bread to fungi

3 結論與討論

3.1 培養基種類的選擇

沒有一種培養基或一種培養條件能夠滿足自然界中一切生物的生長，在一定程度上所有的培養基都是有選擇性的 (沈萍，2002)。我們參照蘇松坤 (2000)的細菌分離方法，對長木蜂蜂糧中的有益細菌進行分離，MRS培養基主要是分離乳酸菌的培養基，本實驗采用MRS(pH4.5)和MRS(pH6.5)培養基分離到大量的酵母菌菌落，而分離到的細菌菌落很少，分離結果與文獻報道不一致，具體原因還有待進一步研究。在NA培養基上，除分離到大量的細菌外，還分離到放線菌菌落，并且發現在放線菌菌落周圍可以抑制其它微生物的生長。由于分離微生物采用的是新鮮樣品進行分離，酵母菌和放線菌生長時間相對較長，由于取樣的限制，我們在分離過程中沒有補充專用酵母菌和放線菌的分離培養基，針對選擇的幾種培養基分離到的菌株進行了微生物群落的分析，可能還不能完全涵蓋長木蜂蜂糧微生物的全貌，在以后的研究中有待進一步改進。

3.2 長木蜂蜂糧中微生物的變化規律

本實驗結果表明，長木蜂蜂糧中細菌和酵母菌屬于優勢菌株，在芍藥花粉中沒有分離到酵母菌，在芍藥長木蜂花粉中分離到酵母菌，然后隨蜂糧釀制時間的延長，細菌和酵母菌的數量劇增，3日齡酵母菌的數量下降，酸度降低，其變化趨勢與長木蜂蜂糧pH的變化趨勢基本一致 (賀春玲等，2010)。長木蜂蜂糧中也分離到乳酸菌，但在MRS(pH4.5)和MRS(pH6.5)上分離到的菌株數量較少，而在改良LB培養基上分離到得菌株較多，由此也可以看出長木蜂蜂糧中的乳酸菌與茶蜂糧中的乳酸菌菌株區系可能不同。乳酸菌是能從葡萄糖發酵產生大量乳酸的細菌，是長木蜂蜂糧pH值降低的主要原因，本文通過采用BCG乳酸鑒定培養基初步對分離的有抑菌活性的細菌菌株進行乳酸菌鑒定，但具體屬于哪一種乳酸菌還需要進一步鑒定獲得。因此，對長木蜂蜂糧中乳酸菌的來源、分離培養培養基的選擇以及在蜂糧中擔負的抑菌活性功能均有待進一步研究。

3.3 長木蜂蜂糧中微生物來源

蜜蜂蜂糧中細菌主要來自花粉產地的生態環境、蜜蜂自身攜帶和蜂巢內的部分細菌，在蜂糧釀制過程中，由于蜂巢環境和蜜蜂的作用，導致蜂巢中的細菌發生復雜的變化 (蘇松坤，2001)。長木蜂蜂糧中的微生物菌株主要來源于花粉產地的生態環境、長木蜂自身的攜帶和蜂巢內部的環境。長木蜂營巢主要選擇直徑1.2～2.5 cm的枯竹上，雌蜂屬于獨棲性蜂類，多數越冬雌蜂在翌年的4月份另筑新巢，少數利用舊巢，但不論是利用舊巢或另筑新巢，對于舊巢和新巢中的蜂糧微生物培養結果看其區別不大，主要細菌和酵母菌;在不同地點采集的雌蜂，體表微生物分離結果均有酵母菌和放線菌，因此，酵母菌和部分放線菌可能屬于長木蜂雌蜂體表的共生菌，在長期進化過程中形成的，對蜂糧的保鮮有非常重要的意義，對于長木蜂體表微生物對蜂糧釀制過程中的保鮮作用還有待進一步研究。

References)

Dong XZ，Cai MY，2001.Common Bacteria System Identification Manual.Beijing:Science Press．350－398.［東秀珠，蔡妙英，2001.常見細菌系統鑒定手冊.北京:科學出版社．350－398］

Egorova A，1971.Preservative microflora in stored pollen.Veterinariya，8:40－41.

Gilliam M，Prest DB，Lorenz BJ，1989.Microbiology of pollen and bee bread:taxonomy and enzymology of molds.Apidologie，20:53－68.

Gilliam M，1997.Identification and roles of nonpathogenic microflora associated with honey bees.FEMS Microbiology Letters，155:1 －10.

He CL，Ji BZ，Liu SW，2009.Nesting，foraging and food－storing behavior of Xylocopa tranquebarorum.Acta Entomologica Sinica，52(9):984－993.［賀春玲，嵇保中，劉曙雯，2009.長木蜂筑巢和采粉貯糧行為.昆蟲學報，52(9):984－993］

He CL，Ji BZ，Liu SW，2009.Study on the antibacterial activity of the raw extraction from bee bread of Xylocopa tranquebarorum.Journal of Nanjing Forestry University，33(2):17－2l.［賀春玲，嵇保中，劉曙雯，2009．長木蜂蜂糧租提液抑菌活性的研究.南京林業大學學報，33(2):17－2l］

He CL，Ji BZ，Liu SW，2010.Determination of pH and the pollen germination ability during the process from pollen to bee bread of Xylocopa tranquebarorum.Journal of Environmental Entomology，32(1):92－98.［賀春玲，嵇保中，劉曙雯，2010.長木蜂蜂糧釀貯過程中pH和花粉活力的測定.環境昆蟲學報，32(1):92 －98］

Huang XL，1999.Microbiology Experiment Guidance.Beijing:Higher Education Press．58－59.［黃秀梨，1999.微生物學實驗指導.北京:高等教育出版社．58－59］

Ji BZ，Liu SW，Xu LN，Zhang K，2006.Advances on the bee bread research.Chinese Agricultural Science Bulletin，22(8):165－169.［嵇保中，劉曙雯，徐麗娜，張凱，2006.蜂糧研究進展.中國農學通報，22(8):165－169］

Jia SX，Zhang SX，Jia ZD，2001.Acid survival method of bees.Apicultural Science and Technology，(3):18－20.［賈紹興，張水仙，賈振東，2001.蜜蜂的酸性生存法.養蜂科技，(3):18－20］

Jiang CL，Xu LH，2001.Microbial Resources Development and Utilization.Beijing:China Light Industry Press．1－19.［姜成林，徐麗華，2001.微生物資源開發利用.北京:中國輕工業出版社，1 －19］

Ling DW，1999.Classification and Identification and Experimental Method of Lactic Acid Bacteria.Beijing:China Light Industry Press．84－109.［凌代文，1999.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法.北京:中國輕工業出版社，84－109］

Luo LY，Luo CB，Xie JS，Ding YS，1992.Study about domestication and utilization of wild bee on herbage seed breeding farm of red clovcr.Pratacultural Science，9(6):5－8.［羅祿怡，羅次畢，謝繼石，丁應生，1992.紅三葉草種籽場長木蜂的人工訓育及利用研究.草業科學，9(6):5－8］

Shen P，2002.Microbiology.Beijing:Higher Education Press．2 －18.［沈萍，2002.微生物學.北京:高等教育出版社．2－18］

Su SK，2000.Studies on brew mechanism and nutritive value of bee bread.Master thesis of Zhejiang University.［蘇松坤，2000.蜂糧的釀制機理和營養價值的研究.浙江大學碩士學位論文］

Su SK，Chen FL，Yu XP，2002.Mutative rule of bacteria during the ferment from pollen to bee bread.Journal of Zhejiang University，28(5):575－577.［蘇松坤，陳盛祿，余旭平，2002.蜂糧釀制過程中細菌的變化規律.浙江大學學報，28(5):575－577］

Su SK，Chen FL，Yu XP，Lin XZ，Xu FL，2001.Isolation and identification of bacter ia from pollen and bee bread．Journal of Zhejiang University，27(6):627－630.［蘇松坤，陳盛祿，余旭平，2001.花粉和蜂糧中細菌的分離和鑒定.浙江大學學報，27(6):627 －630］

Wu YR，1965.Economic Insect Fauna of China.Fasc.9，Hymenoptera:Apoidea.Beijing:Science Press．4－19.［吳燕如，1965.中國經濟昆蟲志 (第九冊，膜翅目，蜜蜂總科)．北京:科學出版社．4－19］

Yang JB，1996.Biological Basis and Application of Lactic Acid Bacteria.Beijing:China Light Industry Press．177－184.［楊潔彬，1996.乳酸菌－生物學基礎和應用．北京:中國輕工業出版社．177 －184］

Yuan YD，1991.The composition and role of the bee bread.Apiculture of China，(6):36－37.［袁耀東，1991.蜂糧的成分和作用.中國養蜂，(6):36－37］

Zhou DQ，1982.Microbiology Laboratory Manual.Shanghai:Shanghai Science Press:532－574.［周德慶，1982.微生物學實驗手冊．上海:上海科學出版社.532－574］

圖版1 NF－34菌株的抑菌活性Plate 1 The antibacterial activity of strain NF－34