江蘇煙粉虱生物型鑒定與危害程度分析

譚永安，肖留斌，孫 洋，季英華，柏立新

(江蘇省農業科學院植物保護研究所，南京 210014)

煙粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)為世界性、多寄主害蟲，不僅可以取食危害多種寄主植物，而且能夠傳播110多種植物病毒，給多種作物造成了嚴重的經濟損失 (Jones D，2003)。作為一個處于快速進化過程的復合種，煙粉虱遺傳特性極為復雜，可分為多種不同的生物型，到目前為止，已經命名的生物型至少有26個 (Delatte Het al．，2005)。國內研究結果表明:B型煙粉虱在我國廣泛分布 (羅晨等，2005);Q型煙粉虱自2005年首次在云南昆明發現以來 (褚棟等，2005)，隨后在江蘇、浙江、武漢等地區發現其危害 (徐婧等，2006;饒瓊等，2009;沈媛等，2011)，有報道表明Q型煙粉虱已在局部地區大量發生并造成嚴重的經濟損失 (徐婧等，2006);沈媛于2005～2009年對江蘇地區煙粉虱生物型演替進行了較為系統的研究，發現Q型煙粉虱在江蘇地區發生頻率逐年升高，并由蘇中和蘇南地區向蘇北地區擴散，顯示出逐漸取代 B型煙粉虱的趨勢 (沈媛等，2011)。但是，由于不同生物型煙粉虱在寄主范圍、寄主危害程度均存在較大差異 (Nombela G et al．，2011;Bonato O et al．，2007)，因此，需進一步研究明確不同生物型煙粉虱的地理分布特性與當地主要寄主危害程度之間的關系，明確重點防治作物與關鍵防治時期，以優化區域性煙粉虱監測防控策略。本研究在前人的工作基礎上，為進一步探討不同生物型煙粉虱在江蘇省不同農區的發生現狀與發展趨勢，明確江蘇省不同地域、主要受害作物上煙粉虱的生物型種類，探明不同生物型煙粉虱的地理分布與當地主要寄主上發生程度及受害程度之間的關系。作者于2010年煙粉虱發生危害高峰期在江蘇省10個市、25個地點對當地主要受害寄主上煙粉虱的發生危害情況進行了抽樣調查，應用危害指數對不同作物上煙粉虱的發生危害程度進行了比較，同時通過mtDNA COI分子標記技術鑒定各地主要受害寄主上煙粉虱生物型，并在此基礎上構建系統進化樹，以期從宏觀上進一步把握不同生物型煙粉虱在江蘇省的區域性遺傳分布與主要寄主種類，從而指導防治。

1 材料與方法

1.1 寄主范圍及發生程度調查

于2010年煙粉虱發生高峰期，分別在江蘇省蘇南 (無錫、蘇州、南京)、蘇中 (南通、揚州)和蘇北 (徐州、鹽城、宿遷、連云港、淮安)等多個地區調查主要寄主植物上煙粉虱的蟲口密度與危害情況。各地主要寄主植物上煙粉虱的蟲口密度與危害情況調查田塊均采用5點取樣法，每點調查5株，每株分別選上、中、下部葉片各2片，輕輕翻轉葉片，記錄成蟲數。同時采集葉片帶回實驗室鏡檢，統計煙粉虱偽蛹、若蟲及卵的數量。對葉片密集且較難區分上、中、下部葉片的寄主植物，則分別取上部嫩葉和中下部老葉各3片作為鏡檢材料。對寄主植物上煙粉虱若蟲和偽蛹的數量以葉為單位進行統計，參照國內外有關煙粉虱發生程度的標準，將其劃分為4個等級:每葉小于10頭的為1級，記為“+”;10～30頭的為2級，記為“++”;30～50頭的為3級，記為“+++”;大于50頭的為4級，記為“++++”。

1.2 生物型鑒定

1.2.1 樣品采集

于2010年春、秋兩季在江蘇省13個地理區域采集煙粉虱成蟲。采樣時輕輕翻轉寄主葉片，用吸蟲管收集成蟲，成蟲放入75%的乙醇中，－20℃保存備用。

1.2.2 煙粉虱總DNA提取

單頭煙粉虱成蟲經ddH2O清洗后用濾紙吸干，參照羅晨等人的方法提取DNA(羅晨等，2002)。

1.2.3 煙粉虱COI基因的PCR擴增

采用COI的通用引物C1－J－2195(5'－TTG ATT TTT TGG TCA TCC AGA AGT－3')和L2－N－3014(5'－TCC AAT GCA CTA ATC TGC CAT ATT A－3')進行PCR擴增，PCR反應在eppendorf熱循環儀中進行。PCR反應體系包含 DNA(20 ng/μL)3 μL，上游和下游引物 (10 μmol/L)各 1.5 μL，10 × Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，Taq(Takara)(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 15.5 μL。PCR 條件為95℃預變性5 min;95℃變性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸1 min，循環35次;最后72℃再延伸10 min。

PCR產物于1.0%(g/mL)的瓊脂糖凝膠上電泳檢測 (120 V，0.5×TBE)，溴化乙錠 (EB)染色后，在Bio－Rad Gel Doc EQ凝膠成像系統下觀察并拍照記錄結果。

1.2.4 序列測定

在電泳中檢測到目標片段后，用TianGenDNA純化試劑盒進行回收純化，然后由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，每采集點每種寄主上煙粉虱樣品分別測5頭。

1.2.5 序列分析

利用BLAST(NCBI網站)與國內外代表地區的煙粉虱COⅠ序列進行比對，通過Clustal X(序列相同時，則選取其中1條)和DNAstar軟件對DNA序列進行比對及同源性分析，利用MEGA 5.1軟件對序列進行系統發育分析，系統進化樹的構建采用最大組成似然 (Maximum Composite Likelihood)模型，建立NJ(Neighbor－Joining)樹，各個分支的bootstrap置信度用1000次自導復制檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同地理種群煙粉虱樣本的生物型檢測及其系統發育分析

在蘇南、蘇中和蘇北不同生態區域，設置了25個采集樣點，共125個采集樣本，采用mtDNACOI分子標記技術鑒定江蘇不同地理種群煙粉虱的Q、B生物型，并在此基礎上構建系統進化樹。所有樣品測序均得到800 bp以上的片段 (圖1)，分別從每個所測序列中截取720 bp的序列進行分析。通過分子生物學分析軟件DNAMAN結合基因庫序列比對分析發現，在所檢測的125個煙粉虱種群COI基因序列中有118個相同 (序列編號為QJiangsu，簡稱Q－JS)，其余7個COI基因序列一致 (序列編號:B－Jiangsu，簡稱 B－JS)。與已知序列比較 (表1)，以溫室白粉虱為外群，建立NJ樹 (圖2)。由構建的系統進化樹可以看到，本試驗所檢測到的Q－JS與B－JS兩個種群的煙粉虱與溫室白粉虱的遺傳距離較大，首先與溫室白粉虱區別開來。Q－JS序列與已知Q型煙粉虱序列Q－Zhejiang、Q－USA和Q－Japan的同源性高達100%，顯示Q－JS與已知的Q型煙粉虱種群聚為同一進化枝;B－JS與已知B型煙粉虱序列BPakistan、B－Japan、B－Beijing的同源性為100%，表明B－JS與已知的B型煙粉虱種群聚為同一進化枝。上述序列比對與同源性分析結果表明，江蘇不同地理種群煙粉虱Q、B生物型同時存在。

圖1 煙粉虱部分樣品mtCOI DNA基因片段的PCR產物凝膠電泳Fig.1 PCR products of mtCOI DNA M，分子量參照;1－10，煙粉虱樣品;M，Marker;1－10，Bemisia tabaci samples．

圖2 基于COI基因序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of B.tabaci populations based on COI sequences

表1 系統進化分析中引用的其他序列信息Table 1 COI sequences cited in this paper

2.2 不同生物型煙粉虱地理分布及主要寄主危害程度

為全面探究江蘇不同生態農區煙粉虱的生物型分布與主要寄主受害之間的關系，2010年我們在蘇南、蘇中和蘇北不同生態區域的25個采集樣點中涉及了18種主要寄主作物，結合上述生物型檢測結果，分析江蘇不同地理種群煙粉虱的Q、B生物型分布及在主要寄主作物上的發生危害程度(表2)。序列分析檢測結果表明，在所有的采集點與寄主作物上均檢測到Q型煙粉虱。Q型煙粉虱的樣點檢出率為100%，但從樣本的角度看，蘇南、蘇中和蘇北的樣本數分別為40、25、60，其Q型煙粉虱相應的樣本檢出率分別是97.50%、96.00%和91.67%。全省的Q型煙粉虱樣本檢出率為94.40%。從采集寄主上看，Q型煙粉虱在18個寄主上都發生為害，其中在茄科、葫蘆科、錦葵科等經濟作物上發生與危害程度最重，在十字花科、豆科作物上發生為害較輕，在菊科與莧科作物上發生危害最輕。僅在6個采集點、4種寄主、7個樣本上檢測到B型煙粉虱，樣本檢出率為5.6%。從表1可看出，Q型煙粉虱已成為江蘇地區的優勢生物型，在番茄、黃瓜、茄子、棉花、辣椒等經濟作物上蟲口密度大，植株受害重，應重視這類寄主作物上Q型煙粉虱的監測與防控。

表2 江蘇不同地理種群煙粉虱的生物型分布與主要寄主發生危害程度Table 2 The distribution of the different biotype and occurrence level of B.tabaci in main host crops in Jiangsu

3 結論與討論

煙粉虱在世界范圍廣泛分布、寄主植物多樣化，生物型和地理分化明顯。因此，煙粉虱生物型的監測與鑒定工作既是煙粉虱綜合治理的基礎，也直接影響到煙粉虱防控策略的優化。已有研究發現本世紀初煙粉虱在我國的傳播以B型煙粉虱取代白粉虱和當地煙粉虱為主要趨勢 (吳杏霞，2002;臧連生，2005;幐希，2009)，此后Q型逐步取代B型，并在我國大部分地區成為優勢生物型 (徐婧等，2006;饒瓊等，2009)。另外在多個地區也發現非B、Q生物型的存在，如在廣西南寧的南瓜寄主上發現非B型煙粉虱 (廣西型)(邱寶利等，2003);在山東、河北和浙江發現2個非B/Q型 (褚棟等，2005)，其中浙江非B/Q型可能是中國本地種 (臧連生等，2005)。在江蘇省，沈媛等從2005～2009年對江蘇省煙粉虱生物型進行調查時發現B型和Q型煙粉虱都有分布，同時Q型煙粉虱有從江蘇的蘇南和蘇中向蘇北擴散的趨勢，2009年Q型煙粉虱在蘇北的發生分布頻率由2005年的 47.42%上升為 77.78% (沈媛等，2011)。2010年我們采集了江蘇省絕大部分地區煙粉虱種群，涉及18種主要寄主，包括棉花、蔬菜和花卉等，其結果可進一步充實不同生物型煙粉虱在江蘇地區的遺傳分布特性。根據mtDNA COI基因序列分析結果，Q型煙粉虱在江蘇省為主要生物型煙粉虱，占所測總樣本94.40%。同時試驗結果還表明，Q型煙粉虱在蘇南、蘇中和蘇北的比例相差不大，均大于90%，其比例高于沈媛等2009年的檢測結果，說明Q型煙粉虱從蘇南、蘇中擴散到蘇北的頻率在進一步加快，并有取代B型煙粉虱的趨勢。Q型煙粉虱的競爭取代機制是否也存在非對稱互作交配現象尚需進一步研究(Liu et al．，2007)。

通過系統聚類樹分析發現，江蘇地區的Q型煙粉虱與我國浙江、美國和日本的Q型煙粉虱聚為一枝，B型煙粉虱與巴基斯坦、日本和我國北京的B型煙粉虱聚為一枝。從對江蘇地區煙粉虱的寄主危害程度的調查發現，Q型煙粉虱在葫蘆科、茄科、錦葵科等寄主植物上蟲量較高，危害也較重，已經成為危害蔬菜、棉花等安全生產的重要致災因子。特別是由于設施農業在江蘇省大范圍推廣，有利于Q型煙粉虱危害的寄主、越冬的場所逐年增加，同時Q型煙粉虱對多種新型煙堿類殺蟲劑的抗藥性高于B型煙粉虱 (Rauch N and Nauen R，2003)，因此亟待加強設施農業中Q型煙粉虱的防控。

References)

Bonato O，Lurette A，Vidal C，2007．Modelling temperature－dependent bionomics of Bemisia tabaci(Q biotype)．Physiological Entomology，32:50－55．

Chu D，Zhang YJ，Cong B，Xu BY，Wu QJ，Zhu GR，2005．Sequence analysis of mtDNA COI gene and molecular phylogeny of different geographical populations of Bemisia tabaci(Gennadius)．Scientia Agricultura Sinica，38(1):76－85．［褚棟，張友軍，叢斌，徐寶云，吳青君，徐朱國仁，2005．煙粉虱不同地理種群的mtDNA COI基因序列分析及其系統發育．中國農業科學，38(1):76－85］

Chu D，Zhang YJ，Cong B，Xu BY，Wu QJ，2005．Identification for Yunnan Q －biotype Bemisia tabaci population．Chinese Bulletin of Entomology，(42)1:54－56．［褚棟，張友軍，叢斌，徐寶云，吳青君，2005．云南Q型煙粉虱種群的鑒定．昆蟲知識，(42)1:54 －56］

Delatte H，Reynaud B，Granier M，2005．A new silverleaf－inducing biotype Ms of Bemisia tabaci(Homoptera:Aleyrodidae)indigenous to the islands of the south－ west Indian ocean．Bull．Electrochem．Res．，95(1):29 －35．

Jones D，2003．Plant viruses transmitted by whiteflies．European Journal of Plant Pathology，109:195－219．

Liu SS，De Barro PJ，Xu J，2007．Asymmetric mating:interactions drive widespreadinvasion and displacement in a whitefly．Science，318:1769－1772．

Luo C，Yao Y，Wang RJ，Yan FM，Hu DX，Zhang ZL，2002．The use of mitochondrial cytochrome oxidaseⅠ(mtCOI)gene sequences for the identification of biotypes of Bemisia tabaci(Gennadius)in China．Acta Entomologica Sinica，45(6):759－763．［羅晨，姚遠，王戎疆，閻鳳鳴，胡敦孝，張芝利，2002．利用mtDNA COI基因序列鑒定我國煙粉虱的生物型．昆蟲學報，45(6):759 －763］

Nombela G，Beitia F，Muniz M，2001．A differential interaction study of Bemisia tabaci Q－biotype on commercial tomato varieties with or without the Mi resistance gene，and comparative host responses with the B－biotype．Entomologia Experimentalis et Applicata，3:339－344．

Qiu BL，Ren SX，Wen SY，Nasser S．Mandour，2003．Biotype identification of the populations of Bemisia tabaci(Homoptera:Aleyrodidae)in China using RAPD －PCR．Acta Entomologica Sinica，46(5):605－608．［邱寶利，任順祥，溫碩洋，Nasser S．Mandour，2003．利用RAPD－PCR方法鑒定我國煙粉虱的生物型．昆蟲學報，46(5):605－608］

Rao Q，Luo HG，Wang XQ，Zhou GZ，Zhang HY，Luo C，2009．Damage and biotypes identification of Bemisia tabaci(Gennadius)in Wuhan Area．Journal of Huazhong Agricultural University，28(5):535－539．［饒瓊，羅漢鋼，汪細橋，周國珍，張宏宇，羅晨，2009．武漢地區煙粉虱的危害及其生物型鑒定．華中農業大學學報，28(5):535－539］

Rauch N，Nauen R，2003．Identification of biochemical markers linked to neonicotinoid cross resistance in Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)．Arch．Insect Biochem．Physiol．，54(4):165－176．

Shen Y，Du YZ，Ren SX，Qiu BL，2011．Preliminary study of succession of Bemisia tabaci biotypes in Jiangsu Province，China．Chinese Journal of Applied Entomology，48(1):16 －21．［沈媛，杜予州，任順祥，邱寶利，2011．江蘇地區煙粉虱生物型演替研究初報．應用昆蟲學報，48(1):16－21］

Teng X，2009．Distribution status of Bemisia tabaci Q－biotype in China and the phylogenetic analysis on mtCOI sequence．Chinese Academy of Agricultural Sciences Master Dissertation．［幐希，2009．Q型煙粉虱在中國的發生現狀及基于mtCOI序列的系統發育分析．中國農業科學院碩士學位論文］

Wu XX，2002．The occurrence，distribution and molecular identification of B biotype Bemisia tabaci in China．Chinese Agricultural University Ph.D Dissertation．［吳杏霞，2002．我國B型煙粉虱的發生、分布以及分子鑒定．中國農業大學博士學位論文］

XU Q，Wang WL，Liu SS，2006．The damage of Q biotyoe Bemisia tabaci(Gennadius)in Zhejiang Province．Plant Protection，4:121．［徐婧，王文麗，劉樹生，2006．Q型煙粉虱在浙江局部地區大量發生危害．植物保護，4:121］

Zang LS，2005．The competitive replacement and behavioral mechanisms form B biotype betwen non－B biotype Bemisia tabaci in Zhejiang．Zhejiang University Ph.D Dissertation．［臧連生，2005．B型對浙江本地非B型煙粉虱的競爭取代及其行為機制．浙江大學博士學位論文］

Zang LS，Liu SS，Liu YQ，Chen WQ，2005．A comparative study on the morphology and biology between the B biotype and a non－B biotype of Bemisia tabaci from Zhejiang，China．Acta Entomologica Sinica，48(5):742－748．［臧連生，劉樹生，劉銀泉，陳偉強，2005．浙江B型與一非B型 (China－ZHJ－1)煙粉虱形態物學和生物學特性的比較研究．昆蟲學報，48(5):742－748］