骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中亞硫酸鹽及P物質(zhì)含量變化

柳慶坤 秦杏坤 平會 劉曉松 李亞貞 趙建偉

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性退化性關(guān)節(jié)疾病，50歲以上者多發(fā)，膝關(guān)節(jié)疼痛是最常見、最突出的癥狀，常使患者行走困難，活動受限，甚至致殘，嚴(yán)重影響日常生活［1］。臨床上對OA患者的治療，主要是緩減關(guān)節(jié)疼痛、改善關(guān)節(jié)功能，缺乏有效的方法控制和治療OA。隨著對OA的深入研究，人們逐漸認(rèn)識到骨關(guān)節(jié)炎是由多種因素相互作用形成的，OA的生物學(xué)行為涉及到分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和機(jī)械力學(xué)等許多方面，目前普遍認(rèn)為細(xì)胞因子在OA軟骨的破壞上起關(guān)鍵作用，而關(guān)節(jié)疼痛主要與局部P物質(zhì)的作用有關(guān)［2］。有關(guān)亞硫酸鹽在炎癥反應(yīng)中的作用已有報道，它是一種中性粒細(xì)胞抗微生物因子和參與炎癥反應(yīng)的炎性介質(zhì)［3］。而有關(guān)亞硫酸鹽在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的作用尤其是與關(guān)節(jié)疼痛的關(guān)系尚未見報道，因此，我們擬通過收集中重度膝關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液，測定其SO2及P物質(zhì)的含量變化，初步探討亞硫酸鹽對骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年8月至2010年8月我院骨科住院患者36例，男12例，女24例;年齡50～75歲，中位年齡63歲;病史1.5～26.3 年，平均10.5 年。納入標(biāo)準(zhǔn)［4］:(1)符合骨關(guān)節(jié)炎的診斷依據(jù)，分級標(biāo)準(zhǔn)為中重度;(2)至少6個月病史;(3)雙側(cè)膝關(guān)節(jié)炎者，以癥狀嚴(yán)重側(cè)入選;(4)無心血管、肝、腎等重要臟器病變;(5)排除活動性胃腸病變者及曾發(fā)生過消化性潰瘍或胃十二指腸出血病史;(6)排除類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎等其他關(guān)節(jié)疾患。所有病例均為我科初診患者，就診時近6個月未使用其他止痛藥物、皮質(zhì)類固醇藥物及具有消炎鎮(zhèn)痛作用的中藥制劑。

1.2 臨床分組及標(biāo)本留取 所有患者均在無菌操作下抽取患側(cè)膝關(guān)節(jié)液，然后注射玻璃酸鈉注射液2ml(山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán))，1次/周，連續(xù)5周。第8周末隨訪患者并在無菌操作下抽取患側(cè)膝關(guān)節(jié)滑液。每次所取關(guān)節(jié)液至少2ml，所得標(biāo)本3000 r/min，離心 10min，取上清液 200 μl，－70℃凍存。血清來自臨床常規(guī)生化檢測后剩余標(biāo)本。根據(jù)患者病程共分為3組，每組36例:(1)急性期組:患者確診膝關(guān)節(jié)炎，分級為中重度，需行關(guān)節(jié)腔減壓治療;(2)恢復(fù)期組:經(jīng)5個療程的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉，第8周復(fù)查患者;(3)隨訪期組:經(jīng)治療后癥狀明顯好轉(zhuǎn)半年以上。3組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，具有可比性。

1.3 實驗方法

1.3.1 亞硫酸鹽含量測定:取關(guān)節(jié)液 100 μl，加入 70 μl硼氫化鈉，室溫孵育 30min，加入 5 μl mBrB，充分混勻，42℃孵育10min，然后加 40 μl高氯酸混勻，12400 × g，室溫離心 10min，取上清，加 10 μl Tris液(2.0 mol/L，pH 值 3.0)輕輕混勻，12400 ×g，室溫離心10min，留取上清液4℃避光保存。取標(biāo)本 5 μl進(jìn)樣分析，流動相 A:甲醇:乙酸:水(5∶0.25∶94.75，體積比，pH值3.4)，流動相B:甲醇。甲醇洗脫梯度:0～5min 5%;5～10min 35%;10～17min 45%;17.01～22min 100%;22.01～27min 5%。流速:1.0ml/min。激發(fā)波長392 nm，檢測波長479 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:以Na2SO3作為標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋為如下濃度:0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6 μmol/L，按上述步驟處理后進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見圖1。

圖1 亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 P物質(zhì)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的檢測:采用ELISA法檢測，試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，嚴(yán)格按說明操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中P物質(zhì)、IL-1、IL-6和IL-8的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中各因子含量變化 膝關(guān)節(jié)液中亞硫酸鹽含量在恢復(fù)期較急性期顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.975，P ＜0.01);而隨訪期關(guān)節(jié)液中亞硫酸鹽含量較恢復(fù)期雖然有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.683，P＞0.05)。P物質(zhì)、IL-1、IL-6和IL-8在膝關(guān)節(jié)液中的含量變化與亞硫酸鹽基本一致，恢復(fù)期較急性期顯著降低(t值分別為16.901、14.960、12.089 和 13.264，P ＜0.01);但是，隨訪期 P物質(zhì)和IL-1較恢復(fù)期進(jìn)一步降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為6.659和 7.221，P ＜0.01);而 IL-6和 IL-8雖然也有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為2.354和1.352，P ＞0.05)。

表1 膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中各因子含量變化

表1 膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中各因子含量變化

注:與恢復(fù)期比較，*P ＜0.05

項目 急性期 恢復(fù)期 隨訪期亞硫酸鹽 (μmol/L)9.2 ±3.3 4.4 ±2.2 3.6 ±2.2 P物質(zhì)(ng/L) 92±24* 72±19 60±16*IL-1(ng/L) 43±10* 23±9 10±6*IL-6(ng/L) 168±34* 120±19 106±21 IL-8(ng/L) 241±27*125±12 118±24

2.2 患者膝關(guān)節(jié)液中亞硫酸鹽和P物質(zhì)的相關(guān)性分析 OA患者的膝關(guān)節(jié)液中亞硫酸鹽和P物質(zhì)，具有相關(guān)性(r=0.804，P ＜0.05)。見圖2。

圖2 膝關(guān)節(jié)液中亞硫酸鹽與P物質(zhì)水平相關(guān)性分析

3 討論

OA是一個復(fù)雜的多因子的關(guān)節(jié)退行性病變，其發(fā)病過程有多種機(jī)制參與。其中炎癥是主要的發(fā)病機(jī)制，通過改變細(xì)胞因子體系參與OA的發(fā)病過程［4－7］。而OA患者的關(guān)節(jié)疼痛除與軟骨下骨暴露和骨內(nèi)壓增高有關(guān)外，主要與P物質(zhì)有關(guān)［8］。關(guān)節(jié)滑膜阻止中的P物質(zhì)是一種強(qiáng)致痛物質(zhì)，可直接激活滑膜組織的痛覺感受器(C類纖維)，而且刺激巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)這些細(xì)胞的吞噬作用、作用和血管的滲出。單核細(xì)胞受到P物質(zhì)的刺激釋放IL-1和腫瘤壞死因子以及其他細(xì)胞因子，這些炎性介質(zhì)又可激活成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞釋放膠原酶和蛋白酶，后者進(jìn)入關(guān)節(jié)液中刺激骨膜和末梢神經(jīng)產(chǎn)生疼痛。國內(nèi)已有學(xué)者通過測定輕、中、重度膝關(guān)節(jié)OA患者膝關(guān)節(jié)液中P物質(zhì)與白介素1β的含量。發(fā)現(xiàn)OA組膝關(guān)節(jié)液中P物質(zhì)和白介素1β濃度顯著高于對照組;滑液中白介素1β濃度與OA嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，滑液中P物質(zhì)與OA嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，滑液中白介素1β與P物質(zhì)濃度呈正相關(guān)。認(rèn)為P物質(zhì)和白介素1β與膝OA的發(fā)病和病情發(fā)展密切相關(guān);且兩者在OA的發(fā)病及病情發(fā)展中可能發(fā)揮相互協(xié)同作用［2］。

近年來，有關(guān)氣體信號分子在OA發(fā)病過程中的作用已有報道，Cillero-Pastor等［9］研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮(nitric oxide，NO)可通過調(diào)節(jié)線粒體功能降低OA患者滑膜細(xì)胞的活性。Whiteman等［10］通過檢測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、OA和健康志愿者的關(guān)節(jié)滑液中的硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)，發(fā)現(xiàn)三者血漿H2S無明顯差異，而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液中的H2S含量顯著高于骨關(guān)節(jié)炎和健康志愿者。由此可以看出，氣體信號分子在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中發(fā)揮一定的病理生理學(xué)作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)液中亞硫酸鹽含量在恢復(fù)期較急性期顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而隨訪期關(guān)節(jié)液中亞硫酸鹽含量較恢復(fù)期雖有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。P物質(zhì)、IL-1、IL-6和IL-8在膝關(guān)節(jié)液中的含量變化與亞硫酸鹽基本一致，恢復(fù)期較急性期顯著降低。值得注意的是，隨訪期P物質(zhì)和IL-1較恢復(fù)期進(jìn)一步降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這與文獻(xiàn)報道一致［2］。骨關(guān)節(jié)炎患者的膝關(guān)節(jié)液中亞硫酸鹽和P物質(zhì)二者具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.804(P＜0.05)。進(jìn)一步提示P物質(zhì)與亞硫酸鹽參與了骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病，且與骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛具有一定的相關(guān)性。

總之，內(nèi)源性亞硫酸鹽在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中發(fā)揮著一定的抗感染防御反應(yīng)，同時也與局部的P物質(zhì)協(xié)同引起關(guān)節(jié)的疼痛。但是，有關(guān)內(nèi)源性亞硫酸鹽參與骨性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

1 Stevens-Lapsley JE，Kohrt WM.Osteoarthritis in women:effects of estrogen，obesity and physical activity.Womens Health(Lond Engl)，2010，6:601-615.

2 雷光華，高曙光，李康華，等.P物質(zhì)與白細(xì)胞介素1β在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用及其相關(guān)性.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12:7237-7240.

3 Mitsuhashi H，Nojima Y，Tanaka T，et al.Sulfite is released by human neutrophils in response to stimulation with lipopolysaccharide.J Leukoc Biol，1998，64:595-599.

4 Fransen M，Bridgett L，March L，et al.The epidemiology of osteoarthritis in Asia.Int J Rheum Dis，2011，14:113-121.

5 Driban JB，Balasubramanian E，Amin M，et al.The potential of multiple synovial-fluid protein-concentration analyses in the assessment of knee osteoarthritis.J Sport Rehabil，2010，19:411-421.

6 Stannus O，Jones G，Cicuttini F，et al.Circulating levels of IL-6 and TNF-α are associated with knee radiographic osteoarthritis and knee cartilage loss in older adults.Osteoarthritis Cartilage，2010，18:1441-1447.

7 Santosml，Gomes WF，Pereira DS，et al.Muscle strength，muscle balance，physical function and plasma interleukin-6(IL-6)levels in elderly women with knee osteoarthritis(OA).Arch Gerontol Geriatr，2011，52:322-326.

8 陳百成，王曉峰，張靜，等.膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜中神經(jīng)生長因子和P物質(zhì)水平測試與觀察.中華骨科雜志，2003，23:156-160.

9 Cillero-Pastor B，Martin MA，Arenas J，et al.Effect of nitric oxide on mitochondrial activity of human synovial cells.BMC Musculoskelet Disord，2011，12:42.

10 Whiteman M，Haigh R，Tarr JM，et al.Detection of hydrogen sulfide in plasma and knee-joint synovial fluid from rheumatoid arthritis patients:relation to clinical and laboratory measures of inflammation.Ann N Y Acad Sci，2010，1203:146-150.