一個Pendred綜合征家系的臨床及SLC26A4基因檢測分析△

陶崢 柴永川 李磊 李曉華 楊濤 吳皓

·臨床研究·

一個Pendred綜合征家系的臨床及SLC26A4基因檢測分析△

陶崢1柴永川2，3＃李磊2，3李曉華2，3楊濤2，3吳皓2，3

目的 探討Pendred綜合征的臨床表現及SLC26A4基因檢測特點。方法 對一個多人患病的Pendred綜合征家系進行詳盡的臨床表型分析，并對其中4例耳聾患者進行SLC26A4基因全編碼序列及側翼序列的檢測。結果 該家系共三代15人，其中6人（40.0%）為耳聾患者，6例均為語前感音神經性聾，2例（Ⅰ－3和Ⅱ－7）表現為言語障礙，5例（Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅱ－7、Ⅲ－1、Ⅲ－2）伴單純甲狀腺腫大、3例（Ⅱ－5、Ⅲ－1、Ⅲ－2）伴前庭水管擴大。Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅲ－1和Ⅲ－2這4例耳聾患者中共發現SLC26A4基因四種不同的突變，患病成員中先證者（Ⅲ－1）及其父親（Ⅱ－4）、母親（Ⅱ－5）和妹妹（Ⅲ－2）分別具有p.Q514P和p.H723R、p.N392Y和p.H723R、c.1548insC和p.Q514P、p.N392Y和c.1548ins C雙等位基因突變。結論 該家系先證者及其父母、妹妹分別由SLC26A4基因不同復合雜合突變導致Pendred綜合征；在發現的四種突變中，p.Q514P是既往研究未報道的新發突變。

Pendred綜合征； SLC26A4基因； 聽力損失； 基因突變

Pendred綜合征（Pendred syndrome，PS）又稱耳聾－甲狀腺腫綜合征，臨床主要以前庭水管擴大、感音神經性聾和碘有機化功能障礙為特征，后者可表現為甲狀腺腫大和／或高氯酸鹽釋放試驗陽性。PS在遺傳學上表現為常染色體隱性遺傳模式，致病基因最先由Everett等［1］在一個PS家系中定位克隆，并被命名為PDS基因。后續研究發現該基因突變也可引起非綜合征型大前庭水管（non－syndromic enlargement of vestibular aqueduct，nsEVA）耳聾［2］。由于PDS基因與溶質蛋白家族SLC26其他成員的結構和功能類似，故PDS基因又重新命名為SLC26A4基因（solute carrier family 26，member 4，SLC26A4）。

目前認為，nsEVA和PS是與SLC26A4有關的同一種遺傳病的兩種不同的表現［3］。近年來，SLC26A4基因在nsEVA和PS疾病中的篩查研究已得到了較為廣泛的開展。本研究對一個多人患病的中國PS家系進行了詳細的分子遺傳學分析，找到了該家系發病的分子病因，并確定了一個從未報道過的新發突變，現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 一個來自上海市的PS家系，總共三代15人，其中有6例耳聾患者，詳細家系圖如圖1，其中患者Ⅰ－3和Ⅱ－7未收集到詳細臨床資料及用于分子遺傳學檢測的血樣，其余4例耳聾患者Ⅱ－4（男，先證者的父親）、Ⅱ－5（女，先證者的母親）、Ⅲ－1（先證者）及Ⅲ－2（女，先證者的妹妹）臨床資料和血樣完整。先證者為（Ⅲ－1）女性，28歲，自出生后即對聲音反應差，現表現為言語障礙，純音測聽示極重度感音神經性聾；患者自11歲起逐漸出現頸部腫大，檢查甲狀腺功能正常，診斷為單純性甲狀腺腫大，除了給予高碘飲食治療外未進行其他治療。體檢發現甲狀腺Ⅱ度腫大，邊界清楚，質地柔軟，無震顫及血管雜音，前庭功能檢查未見異常。家系中另5例患者均表現為先天性感音神經性聾，除患者Ⅰ－3外，其它所有患者均于青春期左右開始伴不同程度的甲狀腺腫大。

1.2 臨床檢查方法 頸部B超；甲狀腺功能檢測，包括血清游離T3、T4（FT3、FT4）、促甲狀腺素（TSH）；純音測聽并對耳聾程度分級診斷，依據歐洲工作組倡導的遺傳性聾的分級標準［4］：輕度聽力損失（20～40 dB HL）、中度聽力損失（41～70 dB HL）、重度聽力損失（71～95 d B HL）及極重度聽力損失（＞95 dB HL）；高分辨率顳骨CT掃描診斷前庭水管擴大的標準為：前庭水管外口至半規管總腳中點直徑≥1.5 mm。

圖1 Pendred綜合征家系遺傳圖譜

1.3 SLC26A4基因突變檢測 在簽署知情同意書后，抽取Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅲ－1及Ⅲ－2患者外周靜脈血2 ml，3.2%檸檬酸鈉抗凝，無菌4℃保存待檢。所有程序均通過上海交通大學醫學院附屬新華醫院倫理委員會的批準。

1.3.1 DNA提取 使用吸附柱吸附DNA分離方法（TIANamp Blood DNA kit）在全血中提取基因組DNA，利用核酸檢測儀（NANODROP 2000）進行定量和純度分析。取一定量的DNA原液稀釋成10 ng／μl的工作濃度，－20℃保存備用，DNA原液－80℃保存。

1.3.2 巢式PCR擴增及測序 在每一個需要擴增的目的基因片段外圍設計兩對引物，遠離目的基因片段的一對引物為外側引物，即第一輪PCR的引物，靠近目的基因片段的一對引物為內側引物，即第二輪PCR的引物。PCR擴增SLC26A4基因編碼區及側翼序列，引物序列、反應體系及反應條件參考柴永川等［5］的方法。兩輪PCR反應結束后將第二輪PCR產物直接測序，測序結果應用Sequencher 4.9軟件進行分析。對于遺傳學上檢測到的新發突變，則選取200例聽力正常的對照人群進行相應位點的檢測，以排除遺傳學上常見的無功能的多肽。

2 結果

2.1 臨床檢查結果 經詳細的病史詢問及體格檢查，家系中有6例（40.0%，6／15）耳聾患者，其中患者Ⅰ－3和Ⅱ－7表現為言語障礙，只能靠手語或書面交流，患者Ⅰ－3甲狀腺無腫大，患者Ⅱ－7甲狀腺Ⅱ度腫大，前庭功能檢查未見異常，患者Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅲ－1及Ⅲ－2顯示甲狀腺功能正常，B超均顯示為結節性甲狀腺腫大；純音測聽（PTA）6例患者均為雙耳極重度感音神經性聾，高頻聽力損失更嚴重；Ⅱ－5、Ⅲ－1及Ⅲ－2的顳骨巖部高分辨率CT提示為前庭導水管擴大（EVA）（表1）。

表1 家系中4例耳聾患者臨床檢查結果

表2 家系中4例耳聾患者SLC26A4基因檢測情況

2.1 SLC264基因檢查結果（表2） 家系中Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅲ－1及Ⅲ－2這4例耳聾患者進行了SLC26A4基因編碼區及側翼序列檢測，患者Ⅱ－4攜帶p.N392Y／p.H723R復合雜合突變、Ⅱ－5攜帶c.1548ins C／p.Q514P復合雜合突變、Ⅲ－1攜帶p.Q514P／p.H723R復合雜合突變、Ⅲ－2攜帶有p.N392Y／c.1548insC復合雜合突變，四種突變的測序峰圖見圖2。在200例聽力正常的對照人群中未檢測出p.Q514P突變。同時，通過Clustal W2在線軟件比較不同物種SLC26 A4基因編碼的蛋白質的差異以進行保守性分析，結果顯示Pendrin蛋白514位上的谷氨酰胺高度保守（圖3）。

圖2 研究家系中SLC26A4基因四種不同突變的測序峰圖

3 討論

PS是引起綜合征型聾的主要疾病之一，其發病率估計為7.5／10萬～10／10萬，大約占遺傳性聾的10%。PS的診斷主要依據為：①雙側感音神經性聾（診斷PS的必備條件）：大多數患者表現為重度－極重度的語前聾，部分患者表現為語后聾，聽力可呈波動性、突發性或進行性下降［6，7］；②內耳形態學異常：所有PS患者都有內淋巴系統擴大，最常見的是前庭水管擴大，其次為Mondini畸形［6，8］，但它們并不是PS患者的特異性表現，因為其它一些少見的疾病如遠端腎小管酸中毒、瓦登伯格綜合征、腮－耳－腎綜合征等在少數情況下也可有前庭水管擴大，同時這些疾病也有各自的特殊臨床表現，應注意鑒別［9］；③甲狀腺碘離子有機化功能障礙：可表現為單純性甲狀腺腫和／或高氯酸鹽釋放試驗陽性，與聽力障礙程度無關；甲狀腺腫大呈進行性，兒童常為彌漫性腫大，在成人大多數有明顯的結節，但無血管雜音及震顫感［10］。通常高氯酸鹽釋放試驗對甲狀腺碘離子有機化功能障礙的判斷具有更好的敏感性，PS患者該實驗呈陽性反應，即第一次行甲狀腺攝131I率檢測后，給予10 mg／kg過氯酸鉀口服，1小時后再行甲狀腺攝131I率檢測，正常人無明顯下降，而該病患者下降大于10%。但值得注意的是體內甲狀腺素的產生是一個多環節的生物合成過程，其他一些影響其合成的因素，如甲狀腺素合成酶的先天性缺陷、橋本甲狀腺炎、抗甲狀腺藥物的應用及甲狀腺內無機碘過多等，高氯酸鹽釋放試驗也會呈陽性反應，因此，高氯酸鹽釋放試驗陽性并不是PS的唯一診斷標準，臨床上診斷PS需要上述三方面綜合考慮。考慮高氯酸鹽釋放試驗具有一定的副作用，本研究家系沒有進行該實驗的檢測，但家系中有詳細資料的4例患者都具有雙側感音神經性聾、雙側前庭水管擴大（Ⅱ－4未做）、單純性甲狀腺腫大，符合PS診斷依據。值得注意的是，對于臨床上僅表現為雙側感音神經性聾和內耳形態學異常（EVA和／或Mondini畸形）而沒有甲狀腺腫大的患者，應注意甲狀腺腫大發生的時間可能在青春期以后或者不發生，此時高氯酸鹽釋放試驗是區別nsEVA和PS的唯一標準。

圖3 p.Q514P在不同物種中的保守性分析 利用ClustlW2軟件在線分析人類Pendrin蛋白514位氨基酸在不同物種中的保守性，結果顯示514位氨基酸在不同物種中高度保守

研究表明，SLC26A4是nsEVA／PS最主要的致病基因，有21個外顯子，編碼含有780個氨基酸殘基的蛋白質pendrin。到目前為止，引起nsEVA和PS疾病的SLC26A4基因突變超過170種（http：／／ww w.healthcare.uiowa.edu／labs／Pendredandbor／slc Mutations.htm）。本研究通過對該PS家系中4例耳聾患者進行SLC26A4基因檢測，發現p.N392Y、c.1548insC、p.H723R、p.Q514P四種突變，所有受檢者都有SLC26A4雙等位基因的突變，符合PS隱性遺傳規律。這四種突變中，三種突變（p.N392 Y、c.1548insC和p.H723R）在既往文獻中已報道，其致病性明確，且p.H723R是中國人群中僅次于c.919－2 A＞G的熱點突變，占總突變數的9.04%，而p.N392Y也是較為常見的突變之一，占2.82%［11］。c.1548insC屬于移碼突變，此突變將引起含有780個氨基酸殘基的Pendrin截斷255氨基酸，即突變型Pendrin僅有525個氨基酸殘基，同時Fuqazzola等［12］曾對Pendrin蛋白截斷到548個氨基酸殘基的移碼突變p.S523fsX548進行功能學研究，證實突變型蛋白在細胞膜失去了正常的陰離子轉運功能，致病性明確，而相對于p.S523fsX548，c.1548insC引起的突變型蛋白截斷的更多，其致病性毋庸置疑。c.1541A＞C（p.Q514P）是一個新發現的突變，位于SLC26A4基因的13外顯子上，此改變導致了第514位的親水性氨基酸谷氨酰胺被疏水性氨基酸脯氨酸所取代。推測p.Q514P是一個致病性錯義突變，理由如下：①此突變在200例對照人群中未檢出；②突變氨基酸具有高度保守性：Pendrin蛋白514位上的谷氨酰胺具有高度保守性（圖3），這種進化上的高度保守性說明谷氨酰胺對Pendrin蛋白的功能至關重要；③突變p.Q514P導致脯氨酸替代了514位的谷氨酰胺，而Pera等［13］通過功能實驗證實在蛋白質水平上脯氨酸的增減對Pendrin蛋白的功能是有害的，一般是致病突變；④具有p.Q514P突變的患者在另外一等位基因上具有一個已明確的致病突變，并且除此之外未發現任何可疑的致病突變，這與PS疾病的隱性遺傳模式一致。值得注意的是，以上四點只是對p.Q514P具有突變致病性的有力的間接證據，而p.Q514P是否真正致病及突變型Pendrin如何致病需要進一步的功能試驗進行驗證。

PS患者在聽力學上主要表現為雙側感音神經性聾，以高頻聽力損失為主，聽力圖多為下降型，少部分為平坦型。然而，聽力損失發生的時間和程度可呈現多樣性，多數患者表現為先天性的重—極重度感音神經性聾，若沒有及時干預則出現明顯的言語障礙，文中報道的家系中6例聽力損失者的聽力狀況與此一致；另外，部分患者的聽力損失可表現為緩慢進行性下降，這類患者常出現在兒童后期，一般存在前庭水管擴大，頭部外傷多為聽力進一步惡化的誘因［14］；少數PS患者可有耳鳴，甚至出現眩暈［15］。目前對于PS患者的感音神經性聾無有效治療方法，聽力損失較輕時可以佩戴助聽器以改善聽力，當佩戴助聽器無效時，人工耳蝸植入可作為一種重要的治療手段，并且大多數患者能取得較為滿意的效果［16］；對于甲狀腺腫，一般使用甲狀腺素替代治療，大多不宜手術治療，因致病因素持續存在，術后易復發，且甲狀腺功能在術前多屬正常，術后易出現甲狀腺功能低下、甲狀旁腺功能低下及喉返神經損傷等并發癥。

因PS缺乏特效及經濟的治療方法，給患者本人和社會帶來嚴重的負擔，作為一種常見的隱性遺傳性疾病，可通過致病基因檢測、遺傳咨詢及產前診斷預防該病患兒的出生。本家系遺傳圖譜顯示，患者Ⅱ－4和Ⅱ－5屬于同征婚配，其后代將100%罹患本病，若婚前明確遺傳學病因并避免同征婚配，則完全可以預防患者Ⅲ－1和Ⅲ－2的出生，即使父母為SLC26 A4基因突變的攜帶者，也可以通過產前基因診斷有效地避免聾兒的出生。因此，對本病的臨床認識以及基于臨床診斷的分子遺傳學研究將成為本病早發現、早診斷、早干預及有效預防的關鍵。

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（2012－06－18收稿）

（本文編輯 李翠娥）

CIinicaI and MoIecuIar Diagnosis in a Big Chinese FamiIy with Pendred Syndrome

Tao Zheng*，Chai Yongchuan，Li Lei，Li Xiaohua，Yang Tao，Wu Hao
（*Department of OtoIaryngoIogy，ChiIdren MedicaI Center AffiIiated to Shanghai Jiaotong University SchooI of Medicine，Shanghai，200127，China）

Objective To elucidate the clinical diagnosis and molecular pathogenesis of Pendred syndrome in a big Chinese family.Methods Clinical materials and DNA sample were obtained from the Pendred syndrome family.The exons and the flanking splicing sites of SLC26A4 were screened in the 4 major patients in this family by nested PCR and direct sequencing.ResuIts The clinical characterizations of patients in this family included the prelingual sensorineural hearing loss，dysphonia，goiter，normal thyroid function and enlarged vestibular aqueduct.A total of 4 different types of SLC26 A4 mutations were identified in the family.The proband，his father，his mother and his sister were carried with different SLC26 A4 biallelic mutations which were p.Q514P and p.H723R，p.N392Y and p.H723R，c.1548insC and p.Q514P，p.N392Y and c.1548insC，respectively.ConcIusion The proband，his father，his mother and his sister with Pendred syndrome were caused by different biallelic mutations of SLC26A4.In the 4 types of SLC26A4 mutations，p.Q514P is novel，which has not been yet reported in the previous literatures.

Pendred syndrome； SLC26 A4 gene； Hearing loss；Mutation

10.3969／j.issn.1006－7299.2012.06.006

時間：2012－11－01 12：48

R764.44

A

1006－7299（2012）06－0528－05

△ 國家自然科學基金（30971596；81170924）、衛生部公益性行業科研專項經費項目（201202005）、上海市教育委員會和上海市教育發展基金會“曙光計劃”（09SG19）、上海市浦江人才計劃（11PJ1407000）、上海高校特聘教授（東方學者）崗位計劃資助

1 上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心耳鼻咽喉科（上海 200127）； 2 上海交通大學醫學院附屬新華醫院耳鼻咽喉－頭頸外科；3 上海交通大學耳科學研究所

陶崢，女，上海人，副主任醫師，主要研究方向為兒童聽力障礙的診治、干預。柴永川，男，江西人，在讀博士研究生，主要研究方向為聾病的遺傳及分子生物學研究。

吳皓（Email：wuhao622＠sh163.net）；楊濤（Email：yangtfxl＠sina.com）

＃ 為并列第一作者

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20121101.1248.017.html