D101大孔吸附樹脂法富集補骨脂中補骨脂酚的研究*

劉二偉，王家龍，韓立峰

補骨脂為豆科植物補骨脂（PsoraleacorylifoliaL.）的干燥成熟果實，性溫，味辛，為常用中藥。已從補骨脂中分離出的化學成分50余種，包括呋喃香豆素類補骨脂素和異補骨脂素、單萜酚類補骨脂酚、黃酮類新補骨脂異黃酮、Corylifol A、補骨脂二氫黃酮甲醚等成分。補骨脂具有植物雌激素樣作用，雌激素的效應主要由兩種受體雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ）介導。研究表明激活ERα可促進乳腺癌細胞增殖，而ERβ的激活則對腫瘤細胞生長起抑制作用，因此對ERβ選擇性激活的藥物被認為是長期使用雌激素的更安全的替代品。本課題組前期研究結果表明，補骨脂酚選擇性的激活ERβ，而補骨脂素和異補骨脂素選擇性的激活ERα。在提取物制備工藝中需要去除補骨脂素和異補骨脂素而富集補骨脂酚，這對于補骨脂的安全應用具有重要意義[1-6]。

1 儀器和試劑

Waters 2695液相色譜系統；乙腈（色譜醇，TEDIA）；補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚（實驗室自制，經結構確證，質量分數≥98%）。補骨脂藥材（購自河北安國祁新中藥顆粒飲片有限公司，經天津中醫藥大學中醫藥研究院郭俊華副研究員鑒定）。D101大孔吸附樹脂（天津市海光化工有限公司，凈品級）。

2 分析方法

2.1 色譜條件 Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%醋酸水溶液，梯度洗脫，見表1，體積流量1.0 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫 20℃，進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫流動相比例

2.2 線性關系 精密稱取補骨脂酚5.79 mg、補骨脂素16.35 mg和異補骨脂素10.30 mg，分別置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度制成對照品儲備液。分別精密量取各儲備液至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，測定，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程：補骨脂酚Y贊=0.174 5X+2.114 2，決定系數 r2=0.999 4，線性范圍 46.3~231.6 μg；補骨脂素Y贊=7.025 3X+0.540 7，決定系數r2=0.999 3，線性范圍0.108~4.860 mg；異補骨脂素Y贊=7.428 7X+0.568 1，決定系數 r2=0.999 3，線性范圍0.105~4.730 mg。

3 制備工藝的研究

3.1 補骨脂藥材的提取 取補骨脂藥材1 kg，95%乙醇回流提取2次，每次10 L，2 h，回收乙醇至盡后真空干燥，得補骨脂提取浸膏187.0 g，備用。

3.2 補骨脂提取物的溶解 取步驟3.1所得補骨脂提取物3份，每份4 g。樣品1、樣品2和樣品3分別對應加入1%、2%、3%氫氧化鈉水溶液，觀察溶解情況，結果見表2。

表2 堿水溶解補骨脂樣品結果

由表2可見：氫氧化鈉濃度直接影響補骨脂提取物的溶解，盡量少的使用和選擇低濃度氫氧化鈉是優選原則，濃度過小（1%）達不到溶解目的，因此選擇使用2%氫氧化鈉水溶液溶解補骨脂提取物。

3.3 酸沉淀初步富集補骨脂酚 為了初步富集補骨脂酚可以加酸調節pH值，補骨脂酚會不斷析出，同時補骨脂素和異補骨脂素也會重新環合成內酯，因此調節加酸的量并優化加酸的濃度，可以有選擇性的沉淀出補骨脂酚而將大部分補骨脂素和異補骨脂素留在堿水溶液中，同時去除大部分其他水溶性成分，實現目標成分初步富集純化目的。

取步驟3.1所得補骨脂提取物3份，每份4 g。分別加入2%氫氧化鈉水溶液28.0 mL溶解。滴加10%鹽酸沉淀，分別調節pH值至10.0、8.0、6.0，靜置過夜，固液分離，溶液依次記錄為母液1、母液2、母液3。沉淀分別用60 mL 95%的乙醇溶解，確定體積，依次標記為沉淀1、沉淀2和沉淀3，觀察沉淀狀態并按2.2色譜條件測定母液和沉淀中補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚的含量，以溶液和沉淀中補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚的分配為指標優化酸沉淀pH值條件，結果見表3。

表3 補骨脂堿水溶液加酸沉淀結果mg

加酸的量直接影響補骨脂堿溶液中補骨脂酚的沉淀效果，實驗過程中發現，加酸調節pH值至10.0時即有大量沉淀產生，并且母液顏色較深，到8.0時母液顏色變為紅棕色，到6.0時變為淺黃色，沉淀量增加。數據顯示，調節pH值至10.0時補骨脂酚已經大部分析出，隨著加酸量的增加補骨脂素和異補骨脂素卻大量增加，因此，選擇補骨脂提取物堿溶液加鹽酸調節pH值至10.0的工藝。

3.4 大孔吸附樹脂純化工藝條件的確定

3.4.1 大孔吸附樹脂富集補骨脂酚動態吸附實驗 吸附曲線的繪制有利于確定樹脂對補骨脂酚吸附能力的大小，稱量提取物28.5 g，按步驟3.3堿水溶解后加鹽酸沉淀，沉淀加入700mL2%氫氧化鈉水溶液溶解，溶液上預處理好的D101大孔吸附樹脂柱（直徑 2.0 cm，高 45 cm，柱體積（BV）=70 mL），流速3mL/min。每個柱體積接樣1次，順序接收6份。HPLC測定溶液中補骨脂酚的含量，以流出液柱體積對流出液補骨脂酚濃度（mg/mL）作圖，結果見圖1。

圖1 大孔吸附樹脂富集補骨脂酚的吸附曲線

由圖1可見：補骨脂酚上樣量達到2倍柱體積時開始泄露，即達到飽和，折算為補骨脂95%乙醇提取浸膏，上樣量低于0.08 g/mL樹脂。

3.4.2 大孔吸附樹脂富集補骨脂酚的動態洗脫實驗 稱取補骨脂95%乙醇提取物3.5g，按步驟3.3堿水溶解后加鹽酸沉淀，靜置過夜后固液分離，沉淀加入2%氫氧化鈉水溶液溶解，上預處理好的D101大孔吸附樹脂柱（直徑2.0 cm，高45 cm，柱體積BV=70 mL），流速3 mL/min。上柱完畢水沖洗3 BV，30%乙醇沖洗3 BV后用95%乙醇洗脫，每0.5柱體積接樣1次，共接收8份。HPLC法測定每份樣品中補骨脂酚的濃度，以洗脫體積（0.5 BV）對補骨脂酚濃度（mg/mL）作圖，結果見圖2。

由圖2可見：95%乙醇可以作為補骨脂酚的洗脫溶劑，洗脫溶液接收到1 BV時補骨脂酚開始流出，3 BV時大部分補骨脂酚已經洗脫，因此選擇加入3 BV的95%乙醇洗脫的工藝。

圖2 大孔吸附樹脂富集補骨脂酚的洗脫曲線

4 制備工藝的驗證

稱取補骨脂95%乙醇提取物30.0 g，2份，分別按步驟3.3堿水溶解后加鹽酸沉淀，靜置過夜后固液分離，沉淀加入210 mL 2%氫氧化鈉水溶液溶解，溶液上預處理好的D101大孔吸附樹脂柱（直徑5cm，高50 cm，床體積BV=600 mL），流速10 mL/min。上柱完畢水沖洗3 BV，30%乙醇沖洗3 BV后，用95%乙醇洗脫3 BV，減壓濃縮至干，得12.2 g樣品1、12.9 g樣品2。HPLC測定兩個樣品中補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚的百分含量。結果見表4。

表4 工藝驗證試驗樣品中補骨脂酚含量 %

驗證結果顯示本研究確定的工藝可以用于富集補骨脂中的補骨脂酚，所得提取物不含補骨脂素和異補骨脂素，工藝穩定，重現性好，平均含量達45.6%。

5 討論

本實驗利用補骨脂素和異補骨脂素堿性條件下開環成鹽后易溶于水不能被大孔吸附樹脂吸附的性質，巧妙的將兩者分開，達到富集補骨脂酚的目的。實驗證明，本研究確定的工藝可以用于制備不含補骨脂素和異補骨脂素，補骨脂酚含量達到40%以上的補骨脂提取物，為補骨脂的植物雌激素作用的臨床應用提供了安全保證。

[1]郭江寧，吳 候，翁新楚，等.補骨脂活性成分的提取分離與抗癌實驗研究[J].中藥材，2003，26（3）：185－187.

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