微生物轉化法制備人參皂苷Compound K的研究進展

李 學，臧 埔，張連學*，郜玉鋼*，李 萍，郝建勛，王亞星

(吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118)

微生物轉化法制備人參皂苷Compound K的研究進展

李 學，臧 埔，張連學*，郜玉鋼*，李 萍，郝建勛，王亞星

(吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118)

稀有人參皂苷Compound K(CK)是二醇型非天然人參皂苷，是其他二醇型人參皂苷在人體腸道內的降解產物。因其在抗腫瘤等方面有特效，需大量制備以滿足醫療和科研需要，因此，有效獲得稀有人參皂苷CK已開展了大量研究。本文就人參皂苷CK的微生物轉化及制備進行系統的綜述，旨在為其進一步開發利用提供參考。

人參；人參皂苷CK；微生物轉化

人參皂苷具有很高的藥用價值，是人參中主要的活性成分，目前，已經分離鑒定出人參皂苷50余種[1]。根據人參皂苷的結構類型、糖基的數量和位置，中外學者已分離鑒定出3種皂苷類成分的苷元：達瑪烷型(dammarane)，水解后生成皂苷元人參二醇或人參三醇；齊墩果烷型(oleanane)；奧克梯隆型(octotillol)。人參稀有皂苷Compound K(CK)屬二醇型人參皂苷，其不存在于人參中，而是其他二醇型人參皂苷在人腸道內的降解產物，是發揮作用的活性物質。研究發現CK在體內外都有良好的抑制癌細胞生長和轉移的作用，是一種潛在抗癌藥物，并且在抗衰老、改善記憶、抗炎等各方面都有一定的療效。因此，如何獲得大量的CK是現代藥學研究的重點。近年來，利用微生物轉化制備人參皂苷CK取得了一定成果，同時也推進了對轉化機制研究，但還遠不能滿足人們的需求，對于微生物轉化制備CK的產業化研究仍需引起人們的進一步努力。本文針對微生物轉化法制備CK內容進行綜述，為CK產業化開發提供理論依據和參考。

1 人參皂苷CK的結構和轉化機理

CK屬達瑪烷型的四環三萜類皂苷(圖1)，二醇型人參皂苷母核主要在C3和C20位上成苷，糖基多為葡萄糖、木糖和阿拉伯糖；三醇型皂苷母核糖苷鍵主要在C6和C20位，糖基多為葡萄糖、鼠李糖和木糖。人參皂苷因結構中糖基側鏈的不同，顯示出不同的性質和活性。CK在結構上與天然二醇型人參皂苷不同之處是C3和C20位上的糖基，故可對天然二醇型人參皂苷C3和C20位上的糖基進行結構修飾以得到人參皂苷CK。

圖1 人參皂苷化學結構Fig.1 Chemical structures of ginsenosides

為獲得更多極高藥用價值的人參稀有皂苷，從20世紀80年代國內外研究人員就開始對人參皂苷進行結構改造，目標鎖定在對糖基的結構修飾。目前人參皂苷糖基改造的主要方法有化學法[2]、酶解法和微生物轉化法?；瘜W法指用化學催化劑水解皂苷糖基，用于最早的皂苷結構研究，尤以酸水解法使用最多。酸水解過程操作簡單，但專一性差，并且轉化率低[3]。酶解法條件溫和不破壞皂苷結構，反應周期短，專屬性強，得率高，污染小，但是酶容易失活，反應條件也不易控制。相比之下，微生物轉化法成本較低，副產物少，因此得到廣泛應用。

微生物轉化是通過把一種化合物變成相關的更有經濟價值的產物，來完成常規化學方法難以實現的反應的轉化。實際上是通過微生物整體細胞或酶將復雜的底物進行結構修飾，利用微生物代謝過程中產生的某個或某一系列的酶對底物(或外源化合物)進行催化反應[4]。微生物轉化人參皂苷反應機制是微生物產生的酶水解掉人參皂苷中的糖基，從而引起結構的改變而獲得具有一定結構的產物。微生物轉化法的方式是：底物→菌體細胞→反應產物。據文獻報道[5-6]，影響人參皂苷生物轉化的主要因素包括：1)菌種(菌株)：菌種是影響人參皂苷生物轉化的最重要因素。不同的菌種及同一菌種的不同菌株作用于同一底物的轉化產物都可能不同。2)底物：不同底物其轉化速率及產生的轉化產物不同，底物的濃度亦對轉化過程產生很大影響。3)溫度：一般在25～28℃條件下培養。4)pH值：轉化反應的pH值范圍較廣，pH3～7內均可反應。

2 人參皂苷CK的制備

2.1 人參皂苷CK轉化的由來

對于人參皂苷的研究，至今已有百余年的歷史。從1963年Sanada等[7]對山人參根中提取到的總皂苷進行分離、提純及鑒定后，研究人員才開始把人參皂苷作為人參的有效成分來研究。

1972年Yasioka等[8]利用土壤細菌降解Rbl、Rb2和Rc混合物時首次發現了人參皂苷CK并鑒定了其結構為20(S)原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。盡管該化合物早已被發現并鑒定了結構，卻一直未獲得足夠的重視。

直到1991年，日本學者Karikura等[9]在對大鼠腸道內人參皂苷Rbl、Rb2代謝物進行檢測時，再次發現和鑒定了人參皂苷CK，并證明了人參皂苷CK不是胃酸水解產物，而是腸道微生物轉化產物。1996年，Hasegawa等[10-11]系統推測了天然人參皂苷Rbl、Rb2和Rc經腸道微生物轉化成人參皂苷CK的代謝過程，為之后的研究奠定基礎。此后，Akao等[12]證實一些天然人參皂苷在腸道中吸收很少，只是“天然活性前體”，而人參皂苷CK才是真正被吸收和發揮活性作用的實體。從此激發了人們對人參皂苷CK的研究，目前人參皂苷CK藥物研發和工業生產成為所有研究人參皂苷成分中的焦點。

2.2 人參皂苷CK的現代研究

目前CK的轉化法主要是酶轉化法和微生物轉化法。由于人參皂苷四環三萜母核結構上C3和C20位糖苷鍵的特異性，決定了非天然人參皂苷CK的制備多采用生物轉化法，此方法比較溫和，化學方法不適用[13]。

酶轉化法一般采用粗橙皮苷酶、柚苷酶、果膠酶、纖維素酶及乳糖酶等工業酶制劑轉化二醇型人參皂苷混合物來制備CK。它的優點專一性強、工序短、易分離純化，但它也存在酶用量大、成本高的缺點。研究發現也可提取食用微生物Bifidobacterium sp.Int57和Bif.sp.SJ32等中粗酶，通過轉化人參皂苷Rbl、Rb2和Rc來制備CK[14-15]。

微生物轉化法主要是利用腸道厭氧菌和土壤微生物發酵。1)腸道厭氧菌起先只是人排泄物中的總菌群[16]；后來篩選單一腸道菌進行轉化，如Prevotella oris[17]等。2)原始土壤微生物降解人參皂苷的能力較低，必須優化發酵條件和誘變菌種等來提高轉化能力[18]。目前國內外在此方面已有一些研究報道，對CK的產業化研究提供了一些依據。下面就近年來人參皂苷CK制備所需的酶或微生物、材料、轉化方法及研究意義等進行列表。由表1可知，酶轉化法較微生物轉化法研究較少，微生物轉化法是制備CK比較有潛力的方法。微生物轉化的發酵菌種大多數是真菌，開始選用腸道正常菌群，但因腸道菌都是厭氧菌，培養的成本較高，同時產率不大高，所以人們開始尋找一些成本較低的發酵方法來轉化人參皂苷，如大型藥食兼用真菌和食物中的酵母菌等做發酵菌株。研究對象包括人參、三七、西洋參等原藥材及其中含有的總皂苷或單體皂苷，單體皂苷以人參皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd為主，它們的主要轉化途徑為：Rb1或Rb2→Rd→F2→CK，Rc→C-Mc→CK或Rc→Rd→F2→CK，Rd→F2→CK。研究人員大多數是以稀有人參皂苷CK含量提高為研究目標，部分會產生新的人參皂苷，然而人參皂苷CK的工業化生產才是重中之重。發酵工業的生產水平主要取決于3個因素:生產菌種、發酵工藝和設備，優良菌種或菌株的篩選是微生物發酵法轉化活性成分成敗的關鍵。周偉等[30]選用擬青霉菌sp.229為菌種對人參皂苷CK的制備進行了中試研究，通過對培養基和罐上條件的優化成功建立了10L發酵罐三級發酵工藝，后來放大到50L發酵，CK轉化率可達83%。此次中試研究解決了CK制備的瓶頸問題，為CK工業化生產和新藥研發奠定了堅實的基礎。

表1 近年來皂苷CK 制備的研究Table 1 Methods developed for ginsenoside CK production in recent years

微生物轉化法制備CK仍然存在很多問題：首先，篩選出成本低，安全性強，專一性高的高效菌種或菌株仍然是大量制備人參皂苷CK的首要條件；其次，研究轉化途徑發現CK的產生速度最慢是整個轉化反應的限速步驟，因此如何加速CK的轉化，縮短發酵時間是完善制備方法的關鍵。再次，優化培養方案，提升到發酵水平，并且注重CK的分離純化。還有可以尋找可以研究其他一些含有人參皂苷并且價格比較便宜的植物，以擴大當前生藥資源的利用。

3 結 語

人參皂苷CK是天然二醇型皂苷在體內發揮活性的物質，是一個多靶點，高活性化合物。其不但在抗腫瘤、抗炎、抗過敏和保肝等方面體現了良好的活性，而且在神經系統及免疫系統方面也具有很好的調節作用，尤其低毒性高活性的特點使其成為很有應用前景的候選藥物。微生物細胞的增殖比植物細胞更快，基因轉化表達，基因重組，原生質體融合比動植物細胞更容易成功，所以整個過程可以實現自動化，連續化，并且轉化效率更高。目前采用微生物轉化法生產人參皂苷CK是最好的方法。

為實現微生物轉化人參皂苷CK的生產應用，篩選出專一性轉化的高產菌種，尋找合適的工業生產條件，對大規模生產稀有人參皂苷CK具有重大意義，也為以后的臨床應用提供保障。此外對于人參皂苷CK的純化也是一個關鍵步驟，這些都需要研究人員再做大量的研究。

[1]CUI Xiuming, JIANG Zhiyong, ZENG Jiang, et al. Two new dammarane triterpene glycosides from the rhizomes of Panaχ notoginseng[J]. J Asian Nat Prod Res, 2008, 10(9/10): 845-849.

[2]劉娜, 樸虎日, 趙余慶. 稀有抗腫瘤人參皂苷衍生物的制備與分離[J]. 中藥材, 2009, 32(5): 707-709.

[3]徐傳蓮, 付建國. 人參皂苷生物轉化研究進展[J]. 生命的化學, 2004, 24: 132-135.

[4]王身艷, 陳建偉, 張蔚學, 等. 雙向發酵對白芍HPLC指紋圖譜及芍藥苷含量的影響[J]. 現代中藥研究與實踐, 2009, 23(2): 6-9.

[5]SU Jinhuan, XU Jianhe, LU Wenya, et al. Enzymatic transformation of ginsenoside Rg3 to Rh2 using newly isolated Fusarium proliferatum ECU2042[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006, 38 (2): 113-118.

[6]CHENG Leqin, NA J R, BANG M H, et al. Conversion of major ginsenoside Rb1 to 20(S)-ginsenoside Rg3 by Microbacterium sp. GS514[J]. Phytochemistry, 2008, 69(1): 218-224.

[7]SANADA S, KONDO N, SHOJI J, et al. Studies on the saponins of ginseng structures of ginsenoside I, structures of ginsenoside Ro, Rb, Rc,Rd[J]. Chem Pharn Bull, 1974, 22(2): 421-428.

[8]YOSIOKA I, SUGAWARA T, IMAI K, et a1. Soil bacterial hydrolysis leading to genuine aglycone. V. On ginsenosides Rbl, Rb2 and Rc of the ginseng root saponins[J]. Chem Pharm Bull, 1972, 20(11): 2418-2421.

[9]KARIKURA M, MIYASE T, TANIZAWA H, et a1. Studies on absorption, distribution, excretion and metabolism of ginseng saponinis VⅡ comparison of the decomposition models of ginsenoside Rbl and Rb2 in the digestive tract of rats[J]. Chem Pharm Bull, 1991, 39(9): 2357-2361.

[10]HASEGAWA H, SUNG J H, MATSUMIYA S, et a1. Main ginseng saponins metabolites formed by intestinal bacteria[J]. Planta Med, 1996, 62(5): 453-457.

[11]HASEGAWA H, SUNG J H, BENNO Y. Role of human intestinal Prevotella oris in hydrolyzing genseng saponins[J]. Planta Med, 1997, 63(5): 436-440.

[12]AKAO T, KIDA H, KANAOKA M, et a1. Intestinal bacterial hydrolysis is required for the appearance of compound K in rat plasma after oral administration of ginsenoside Rbl from Panaχ ginseng[J]. J Pharm Pharmacol, 1998, 50(10): 1155-1160.

[13]周偉, 周佩. 稀有人參皂苷compound K研究進展[J]. 藥學學報, 2007, 42(9): 917-923.

[14]ZHOU Wei, FENG Meiqing, LI Jiyang, et al. Studies on the preparation, crystal structure and bioactivity of ginsenoside compound K[J]. J Asian Nat Prod Res, 2006, 8(6): 519-527.

[15]WAKABAYASHI C, MURAKAMI K, HASEGAWA H, et a1. An intestinal baeterial metabolite of ginseng protopanaxadiol saponins has the ability to induce apoptosis in tumor cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 246(3): 725-730.

[16]HASEGAWA H, SUNG J H, MATSUMIYA S, et al. Main ginseng saponin metabolites formed by intestinal bacteria[J]. Planta Med, 1996, 62(5): 453-457.

[17]HASEGAWA H, SUNG J H, BENNO Y. Role of human intestinal Prevotella oris in hydrolyzing ginseng saponins[J]. Planta Med, 1997, 63(5): 436-440.

[18]韓穎, 趙余慶, 姜彬慧, 等. 抗腫瘤成分CK微生物轉化高效菌株的篩選[J]. 中藥研究與信息, 2005, 7(2): 17-19.

[19]BAE E A, CHOO M K, PARK E K, et al. Metabolism of ginsenoside Rc by human intestinal bacteria and its related antiallergic activity[J]. Biol Pharm Bull, 2002, 25(6): 743-747.

[20]付建國. 人參皂苷微生物轉化的研究[D]. 長春: 吉林農業大學, 2004.

[21]CHI H, KIM D H, JI G E. Transformation of ginsenosides Rb2 and Rc from Panaχ ginseng by food microorganisms[J]. Biol Pharm Bull, 2005, 28(11): 2102-2105.

[22]崔宇, 姜彬慧, 韓穎, 等. 微生物對人參果總皂苷中人參皂苷化合物K的轉化作用[J]. 中草藥, 2007, 38(2): 189-193.

[23]韓穎, 胡筱敏, 姜彬慧, 等. Fusarium sacchari對三七莖葉中有效成分生物轉化條件的優化[J]. 應用生態學報, 2007, 18(12): 2801-2806.

[24]韓穎, 姜彬慧, 胡筱敏, 等. Fusarium sacchari轉化三七莖葉皂苷的稀有抗腫瘤成分[J]. 中草藥, 2007, 38(6): 830-832.

[25]HAN YING, SUN Baoshan, HU Xiaomin, et al. Tansformation of bioactive compounds by Fusarium sacchari fungus isolated from the soilcultivated ginseng[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55(23): 9373-9379.

[26]昆明諾唯金參生物工程有限責任公司. 一種鏈霉菌發酵三七皂苷制備稀有人參皂苷Compound K的工藝: 中國, 101139562[P]. 2008-03-12.

[27]李幸慰. 人參皂甙Rb3的生物轉化以及擬青霉菌sp.229中代謝產物的分離純化鑒定[D]. 上海: 復旦大學, 2008.

[28]ZHOU Wei, YAN Qin, LI Jiyang, et al. Biotransformation of Panaχ notoginseng saponins into ginsenoside compound K production by Paecilomyces bainier sp.229[J]. J Appl Microbiol, 2008, 104(3): 699-706.

[29]CHEN Guangtong, YANG Min, SONG Yan, et al. Microbial transformation of ginsenoside Rb1 by Acremonium strictum[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 77(6): 1345-1350.

[30]周偉. 稀有人參皂苷compound K的制備和活性研究[D]. 上海: 復旦大學, 2008.

[31]NOH K H, SON J W, KIM H J, et al. Ginsenoside compound K production from ginseng root extract by a thermostable beta-glycosidase from Sulfolobus solfataricus[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2009, 73 (2): 316-321.

[32]金香梅. 微生物轉化人參主皂苷為稀有皂苷CK的研究[D]. 延吉: 延邊大學, 2010.

[33]劉丹. 人參總皂苷的微生物轉化及藥理活性研究[D]. 延吉: 延邊大學, 2010.

[34]李東霄, 常景玲, 張志宏. 微生物轉化人參皂苷Rc和Rd的研究[J].江蘇農業科學, 2010(4): 22-23.

[35]YOO M H, YEOM S J, PARK C S, et al. Production of aglycon protopanaxadiol via compound K by a thermostable β-glycosidase from Pyrococcus furiosus[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 89(4): 1019-1028.

[36]KIM B H, LEE S Y, CHO H J, et al. Biotransformation of Korean Panaχ ginseng by pectinex[J]. Biol Pharm Bull, 2006, 29(12): 2472-2478.

[37]姜彬慧, 韓穎, 趙余慶, 等. 酶轉化三七葉總皂苷制備人參皂苷C-K的工藝優化[J]. 中草藥, 2004, 35(9): 986-989.

[38]JIANG Binhui, ZHAO Yuqing, HAN Ying, et al. Enzymatic transformation of notoginsenoside Fe by β-glucanase [J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2006, 15(1): 6-9.

[39]KO S R, SUZUKI Y, SUZUKI K, et al. Marked production of ginsenosides Rd, F2, Rg3, and compound K by enzymatic method[J]. Chem Pharm Bull, 2007, 55(10): 1522-1527.

Research Progress on Ginsenoside CK Production by Microbial Transformation

LI Xue，ZANG Pu，ZHANG Lian-xue*，GAO Yu-gang*，LI Ping，HAO Jian-xun，WANG Ya-xing
(College of Traditional Chinese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Rare ginsenoside compound K (CK) is a non-natural diol-type saponin. It is a metabolic product from other diol-type saponins in human intestine. Due to its anti-tumor and other beneficial effects, plenty of ginsenoside CK are needed to meet the needs of medical care and scientific research. For this resson, attempts have been done to produce ginsenoside CK effectively under human controlled conditions. In this paper, we review recent progress on ginsenoside CK preparation by microbial transformation, with the purpose to provide some references for future development of better methods to produce ginsenoside CK.

ginseng；ginsenoside CK；microbiao transformation

O629.13

A

1002-6630(2012)11-0323-05

2011-04-19

科技部科技人員服務企業行動計劃項目(2009GJB10031)；第46批中國博士后科學基金項目(20090461042)；科技部科技支撐計劃項目(2011BAI03B01)；國家自然科學基金項目(31070316)；科技部科技成果轉化項目(2010GB2B100100)；吉林省科技條件與平臺建設計劃項目(20112101)

李學(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為生藥學。E-mail：lisnow999@126.com

*通信作者：郜玉鋼(1969—)，男，副教授，博士，研究方向為生藥學。E-mail：gaoyugang_2006@163.com張連學(1956—)，男，教授，博士，研究方向為中藥學。E-mail：zlxbooksea@163.com