單花蜂蜜多酚類物質(zhì)的抗氧化活性

董 蕊，叢海迪，鄭毅男*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

單花蜂蜜多酚類物質(zhì)的抗氧化活性

董 蕊，叢海迪，鄭毅男*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

以5種中國單花原蜜，不同產(chǎn)地的42個樣本通過Amberlite XAD-2吸附樹脂得到的多酚提取物為原料，采用分光光度法，測定總酚酸和總黃酮含量、還原能力、抗氧化活性(清除DPPH自由基、O2－·能力)，評估蜂蜜多酚類物質(zhì)抗氧化活性及蜂蜜品種、顏色和地域差異對清除自由基的影響。結(jié)果表明：樣本總黃酮含量為(9.41±0.18)～(92.76±0.13)mg/kg；總酚酸含量為(9.10±0.05)～(149.57±0.14)mg/100g；深色棗花蜜抗氧化能力最強(qiáng)，對DPPH自由基、O2－·清除作用分別為EC50＝(0.042±0.014)g/mL和EC50＝(0.038±0.009)g/mL。提示蜂蜜的多酚類物質(zhì)影響抗氧化活性，酚酸、黃酮含量與抗氧化能力呈現(xiàn)正相關(guān)系；色深原蜜的酚酸、黃酮含量高于色淺原蜜，抗氧化能力也強(qiáng)于淺色原蜜。

單花蜂蜜；多酚類物質(zhì)；抗氧化活性；顏色；地域

蜂蜜是由蜜蜂從植物花蜜或從植物活體分泌物或植物活體上吸收植物的昆蟲分泌物而生產(chǎn)的，通過蜜蜂采集，與其自身特殊物質(zhì)結(jié)合而轉(zhuǎn)化、存放、脫水、于蜂巢中貯存并留待成熟后的天然甜物質(zhì)。按照GB 18796—2005《蜂蜜》國家新標(biāo)準(zhǔn)的定義：單一花種蜂蜜是指蜂蜜主要采集一種蜜源植物的花蜜或分泌物釀造的蜂蜜[1]。長期以來，在世界各地，蜂蜜一直被作為食品的甜味劑或防腐劑使用[2]；蜂蜜還被用于民間醫(yī)藥，治療各種疾病，如：調(diào)節(jié)胃腸功能紊亂、哮喘、促進(jìn)燙傷和燒傷組織愈合、抵抗病原微生物等疾病[3]。最近，當(dāng)人們越來越關(guān)注抗氧化性功能食品時，又證實蜂蜜在與不穩(wěn)定的氧分子(即自由基)的破壞斗爭中扮演著保護(hù)人類健康的重要角色，蜂蜜具有抗氧化的作用，可有效的減少心臟疾病、癌癥、白內(nèi)障、免疫系統(tǒng)能力降低和不同的炎癥等疾病風(fēng)險[2,4]。這主要是由于蜂蜜成分中除了含有多種糖(主要是果糖和葡萄糖)，還含有豐富的抗氧化物質(zhì)，包括酶類[5](過氧化氫酶、過氧化物酶)和非酶類(有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、抗壞血酸、生育酚、類胡蘿卜素、梅拉德反應(yīng)產(chǎn)物)等物質(zhì)，還有多種多酚類化合物[6]。Ferreira等[7]學(xué)者研究：蜂蜜中這些多酚類成分，起到主要抗氧化作用。包括：酚酸和類黃酮兩類。其中，苯甲酸和肉桂酸及其酯是蜂蜜中最常見的兩種酚酸類化合物；類黃酮類化合物主要是以配基和糖苷形式存在，如：黃酮醇、黃烷酮和二氫黃酮。同時，這些多酚類成分還是區(qū)分蜂蜜植物起源的可能性標(biāo)記[8]。就是說，由于單一花蜜的蜜源植物不同，其含有的多酚類成分種類和含量也有所差別。此外，蜂蜜的顏色、氣味和滋味的不同，都與酚類成分有關(guān)[6]。因此，檢測不同蜂蜜中多酚類成分差異進(jìn)行蜂蜜鑒別和質(zhì)量評價[9]，是蜂蜜現(xiàn)代研究的一個方向。

中國是世界養(yǎng)蜂大國之一，蜂蜜品種和數(shù)量繁多，分布廣泛，但對蜂蜜生物活性研究較少[10-12]，尤其是蜂蜜顏色和地理區(qū)域差異的研究尚未見報道。本研究將以5種不同產(chǎn)地42個未加工的單一花種原蜜的多酚類成分進(jìn)行測定，研究不同花源，甚至同種花源而地域不同的蜂蜜多酚類物質(zhì)對抗氧化作用；蜂蜜顏色(深色或淺色)不同，對抗氧化活性的影響，從而更好地判斷中國蜂蜜質(zhì)量差異，為今后研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃連蜜，毛茛科植物黃連(Coptis chinensisFranch)，三角葉黃連(Coptis deltoideaC.Y.Chenget Hsiao)(H1～H4)；椴樹蜜，椴樹科紫椴(Tilia amurensis)和糠椴(Tilia mandschurica)(H5～H15)；苕子蜜，豆科廣布野豌豆(Vicia craccaL.)和長絨毛野豌豆(Vicia villosa rothL.)(H16～H25)；刺槐蜜，豆科刺槐(Robinia pseudoacaciaL.)(H26～H37)；棗花蜜，鼠李科棗(Ziziphus jujubaMill.var.inermis(Bunge)Rehd.)(H38～H42)，42個樣本均由養(yǎng)蜂人于2009—2010年收集，汪氏蜜蜂園提供，未經(jīng)任何加工處理的原蜜，避光條件下，貯存在0～4℃。

α-生育酚、抗壞血酸、槲皮素、原兒茶酸(以上標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥99.8%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、Amberlite XAD-2吸附樹脂 美國Sigma公司；鎢酸鈉、鉬酸鈉、三氯乙酸(TCA)等(均為分析純) 天津生化試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；UPWS超純水器 杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；BP211D電子分析天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮含量測定

多酚類物質(zhì)提取參考Aljadi等[6]方法：分別稱100g蜂蜜，100mL 蒸餾水稀釋，轉(zhuǎn)入已裝好Amberlite XAD-2吸附樹脂層析柱(25cm×2cm)中，800mL 純凈水洗脫除去糖等極性化合物，再用800mL甲醇洗脫至無色，40℃旋轉(zhuǎn)真空濃縮，甲醇定容至10mL，待用。總黃酮含量測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[13]：吸取1mg/mL供試品2.5mL至25mL 容量瓶，加入5g/100mL NaNO2，混勻，靜置6min，加1g/mL Al(NO3)3，放置6min，加入10g/mL NaOH，加水至刻度，靜置15min，波長510nm處測定吸光度。槲皮素(純度≥99.8%)作標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程：Y＝10.414X＋0.0031(R2＝0.9996)。蜂蜜樣品總黃酮含量(mg/kg)在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)相應(yīng)值。

1.3.2 總酚酸含量測定

采用Folin-Ciocalteau法[14]，移取3mL不同質(zhì)量濃度樣品，加入1mL Folin-Ciocalteau顯色劑，5mL 1mol/L碳酸鈉，蒸餾水定容至10mL，避光1h，760nm波長處測吸光度。標(biāo)準(zhǔn)品原兒茶酸配成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL 按照上述方法測定吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y＝141.23X＋0.0677(R2＝0.9965)。樣品總酚酸含量(mg/100g)在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)值。

1.3.3 還原力測定

以水作空白，抗壞血酸、α-生育酚(用95%乙醇配制)為陽性對照，參照Oyaizu等[15]方法：10mL試管中分別加入不同質(zhì)量濃度(0、0.025、0.05、0.075、0.10g/mL)各樣品1mL，磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L，pH6.6)2.5mL和2.5g/L鐵氰化鉀，50℃水浴反應(yīng)20min，10g/mL三氯乙酸溶液5mL，搖勻。吸取上清液2.5mL，2.5mL蒸餾水、2.5mL三氯化鐵溶液0.5g/mL，混勻，700nm波長處測定吸光度。吸光度越大，樣品還原能力越強(qiáng)。

1.3.4 DPPH自由基清除作用

參考Larrauri等[16]方法：吸取0.1mL 不同質(zhì)量濃度樣品，加0.5mL 0.025mg/mL DPPH甲醇溶液，甲醇定容至5mL，避光1h，于517nm波長處測定吸光度(樣品組)；未加入樣品的DPPH甲醇溶液為空白組。抗壞血酸、α-生育酚為陽性對照。樣品對DPPH自由基清除率用式(1)計算，然后計算EC50。

式中：A樣為樣品管吸光度；A0為空白管吸光度。

1.3.5O2－·清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法測定[17]。取pH8.2的100mol/L Tris-HCl緩沖液2mL，加入各質(zhì)量濃度樣品，加入0.3mL 5×10-3mol/L鄰苯三酚溶液至10mL，3min后，于325nm波長處每隔30s測一次吸光度(不加樣為自氧化反應(yīng))，繪制吸光度-時間曲線，曲線斜率即為自氧化速率。觀察不同質(zhì)量濃度樣品對鄰苯三酚自氧化速度的抑制作用。抑制率計算公式如式(2)所示，然后計算EC50。

式中：A0為空白管吸光度；A樣為樣品管吸光度。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮、總酚酸測定結(jié)果

由表1可知，提取物總黃酮含量從(9.54±0.02)mg/kg到(92.76±0.13)mg/kg，顏色最深的新疆和田(2號)棗花蜜總黃酮含量最高，顏色最淺的云貴高原苕子蜜總黃酮含量最低；同一品種單花蜜由于地域、顏色差異，總黃酮含量也有差異，如：12個刺槐蜜，顏色由水白色到白色，黃酮含量從(9.63±0.07)mg/kg到(14.18±0.07)mg/kg，相差近兩倍；而相同地域的同種單花蜜，顏色和總黃酮含量差異不明顯。5種蜂蜜平均總黃酮含量大小次序為：棗花蜜＞黃連蜜＞椴樹蜜＞刺槐蜜＞苕子蜜。蜂蜜總酚酸含量從(9.10±0.05)mg/100g到(147.11±0.07)mg/100g之間。顏色最深的新疆和田2號棗花蜜總酚酸含量最高，顏色淺的陜北延安刺槐蜜中的含量最低；同一品種不同地域的蜂蜜總酚酸含量也有很大差異。實驗測得：同為淺琥珀色，云貴高原和浙江1號苕子蜜總酚酸含量有一定差異，分別為 (24.32±0.19)mg/100g和(16.09±0.26)mg/100g；而同一產(chǎn)地，河南苕子蜜(H21、H22、H23)總酚酸含量相近，分別為(18.14±0.31)、(18.31±0.29)mg/100g和(19.01±0.14)mg/100g，說明同一品種蜂蜜總酚酸含量因地域不同而有區(qū)別，但同一產(chǎn)地總酚酸含量相近。5種蜂蜜中平均總酚酸含量大小次序為：棗花蜜＞黃連蜜＞椴樹蜜＞苕子蜜＞刺槐蜜。

表1 42個蜂蜜總酚酸、黃酮含量和抗氧化活性EC50值Table 1 Total contents of phenolic and flavonoid compounds and antioxidant activities of 42 unifloral honey samples

2.2 還原能力測定結(jié)果

圖1 不同質(zhì)量濃度蜂蜜的還原力Fig.1 Reducing power of 5 kinds of honey samples with various concentrations

對樣品還原能力測定，可檢驗其是否為一良好電子供應(yīng)者。還原能力與抗氧化活性氧自由基之間有顯著相關(guān)性，還原能力高低可以間接反映抗氧化能力強(qiáng)弱[18]。由圖1可知，隨著加入蜂蜜樣品質(zhì)量濃度增大，還原能力逐漸增強(qiáng)，但5種蜂蜜(色深和色淺)還原能力存在一定差異，總酚酸含量高的棗花蜜和黃連蜜，還原力較強(qiáng)。

由圖2可知，當(dāng)蜂蜜的質(zhì)量濃度為0.1g/mL 時，還原力最強(qiáng)的是新疆和田2號(深琥珀色)和山東2號棗花蜜(深色)，吸光度分別為0.984±0.018和0.935±0.002，而總酚酸含量最低的浙江1號苕子蜜(特淺琥珀色)吸光度僅為0.091±0.016。江西產(chǎn)的刺槐蜜H30和H31，河南的苕子蜜H21、H22和H23，吉林省大興安嶺的椴樹蜜H10和H12，四川的黃連蜜H6和H8，新疆和田的棗花蜜H38、H39和H40，作為同種蜂蜜，由于地域相同，顏色相近，還原能力也相近。5種蜂蜜還原力：棗花蜜＞黃連蜜＞椴樹蜜＞刺槐蜜＞苕子蜜，表明深色蜂蜜多酚提取物比淺色蜂蜜具有更高的還原能力，總黃酮、總酚酸含量高的蜂蜜樣本其還原能力也相對較高。

圖2 質(zhì)量濃度0.1g/mL蜂蜜的還原力Fig.2 Reducing power of honey samples from the same unifloral origin and from the same origin

2.3 對DPPH自由基的清除作用

5種單花蜂蜜酚類提取物對DPPH自由基均有不同程度的抑制作用，呈現(xiàn)量效關(guān)系，即隨著反應(yīng)體系中蜂蜜量的增加，對DPPH自由基的抑制作用也相應(yīng)增加。由表1可知，總酚酸含量最高、深琥珀色的新疆和田2號H38和山東1號H41棗花蜜有較高清除率，EC50值分別為(0.042±0.014)、(0.052±0.005)g/mL；同一品種蜂蜜地域不同，抗氧化能力也有差異，如：四川2號H3和山西忻州H4的黃連蜜，總黃酮含量分別為(58.21±0.07)、(51.83±0.15)mg/kg，對DPPH自由基清除能力EC50值分別為(0.049±0.010)g/mL 和(0.062±0.004)g/mL，清除自由基作用有一定差異；同一品種蜂蜜地域相同，蜂蜜顏色相近：四川黃連蜜H2、H3均為微黃色；河南的苕子蜜H21、H22、H23，淺琥珀色；大興安嶺的椴樹蜜H10、H12，特淺琥珀色，對DPPH自由基清除差異不明顯。由圖3可知，5種蜂蜜對DPPH自由基清除能力：棗花蜜＞黃連蜜＞椴樹蜜＞苕子蜜＞刺槐蜜。說明顏色深的棗花和黃連蜜總酚酸、總黃酮含量很高，對DPPH自由基的抑制作用高于其他蜂蜜。

圖3 5種蜂蜜對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activities of 5 kinds of honey samples on DPPH free radicals

圖4 不同蜂蜜對O2－·的清除作用Fig.4 Scavenging effect of different samples

3 討 論

實驗明確了蜂蜜的多酚類成分對抗氧化活性有很大影響，蜂蜜總酚酸、總黃酮含量和還原能力與體外抗氧化能力呈現(xiàn)積極正相關(guān)系，其總酚酸含量與清除DPPH自由基和O2－·的相關(guān)系數(shù)分別為r＝0.95479和r＝0.71773；還原能力與清除DPPH自由基和O2－·的相關(guān)系數(shù)分別為r＝0.92532和r＝0.75893。同時，顏色最深，總酚酸和總黃酮含量最高的棗花蜜和黃連蜜，抗氧化能力也強(qiáng)于淺色蜂蜜；顏色淺，總酚酸含量低的苕子蜜，還原力和抗氧化能力也最差。說明蜂蜜的顏色不同、花源不同，甚至同種花源而地域不同對抗氧化能力有明顯影響，但是，地域相同的同種花源的蜂蜜抗氧化活性差異較小，可為今后評價蜂蜜質(zhì)量提供一些參考數(shù)據(jù)。

總的來看，蜂蜜作為健康營養(yǎng)物質(zhì)，展示了從深色蜂蜜中提取的多酚類物質(zhì)的抗氧化活性(主要表現(xiàn)在他們的還原能力和對自由基的清除作用)好與淺色蜂蜜。實驗證明，蜂蜜的質(zhì)量取決于它們的化學(xué)成分和植物來源，而蜂蜜中多酚類物質(zhì)的含量受到植物來源、地理來源等的影響，因而鑒定和量化蜂蜜中的多酚類物質(zhì)意義重大。此外，蜂蜜中的多酚類物質(zhì)(如類黃酮和酚酸等)具有很強(qiáng)的抗氧化活性，這一特性對人類的健康有益，所以研究蜂蜜的多酚類物質(zhì)是很有必要的。

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Antioxidant Activities of Phenolic Compounds in Unifloral Honey

DONG Rui，CONG Hai-di，ZHENG Yi-nan*
(College of Traditional Chinese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

A total of 42 samples were collected from honey samples of 5 different unifloral origins (each unifloral origin consisted of different geographic origins in China). Phenolic extract was obtained from these selected samples using Amberlite XAD-2 absorption resin. The contents of total phenolic acids and total flavonoids were spectrometrically determined, and reducing power and the scavenging activity against DPPH and superoxide anion free radicals were tested to evaluate the effects of floral origin, sample color and geographic origin on the antioxidant activity of honey. Total flavonoids content ranged from (9.41 ±0.18) to (92.76 ± 0.13) mg/kg as determined using quercetin as the reference standard. The content of phenolic compounds ranged from (9.10 ± 0.05) to (149.57 ± 0.14) mg/100 g as determined using protocatechuic acid as the reference standard. Dark honey had the highest scavenging activity on DPPH and superoxide anion free radicals with EC50 of (0.042 ± 0.014) g/mL and(0.038 ± 0.009)g/mL, respectively. Conclusion: phenolic extracts from honey samples have impact on their antioxidant activity.The antioxidant potential is positively correlated with the contents of phenolic or flavonoid compounds. Dark honey has higher contents of phenolic and flavonoid compounds as well as stronger antioxidant potential than other light honey.

unifloral honey；phenolic extract；antioxidant activity；color；geographic regions

TS207.3

A

1002-6630(2012)11-0094-05

2011-03-16

董蕊(1975—)，女，講師，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)與新藥開發(fā)。E-mail：drjlau@126.com

*通信作者：鄭毅男(1945—)，男，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)與新藥開發(fā)。E-mail：zhenyinan@tom.com