響應面法優化制備南瓜籽抗氧化肽的工藝

范三紅，毛強強，王亞云，馮雨薇，劉艷榮

(山西大學生命科學學院，山西 太原 030006)

響應面法優化制備南瓜籽抗氧化肽的工藝

范三紅，毛強強，王亞云，馮雨薇，劉艷榮

(山西大學生命科學學院，山西 太原 030006)

以南瓜籽分離蛋白為原料，采用酸性蛋白酶酶解制備南瓜籽抗氧化肽。選用加酶量、酶解溫度、pH值、底物質量濃度、酶解時間作為研究對象，以酶解液對DPPH自由基的清除率為評價指標，在單因素試驗的基礎上，運用Plackett-Burman篩選試驗確定顯著因素，然后通過三因素三水平的Box-Behnken響應面分析法優化制備南瓜籽抗氧化肽的酶解工藝條件。結果表明：酸性蛋白酶酶解南瓜籽蛋白質的最佳工藝條件為：酶解溫度50℃、pH2.5、酶解時間5h、底物質量濃度0.05g/mL、加酶量6000U/g pro，在此條件下，DPPH自由基清除率可達到92.82%。

響應面法；南瓜籽；抗氧化肽；酶解工藝；優化

隨著人們生活水平的提高，活性氧和自由基導致的各種疾病嚴重危害了人類的健康，已經引起了社會各界的廣泛關注。近年來，評價和篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為生物學、醫學和食品科學研究的新趨勢，而各種原料產生的抗氧化肽由于其低毒、高效等特點，成為國內外研究的熱點。

目前，從廉價易得的動植物原料制備抗氧化肽的研究有很多，這些原料主要有大豆蛋白[1]、玉米蛋白[2]、麥胚蛋白[3]、乳蛋白[4]、魚類蛋白[5]等，此外在牛奶蛋白、家蠅幼蟲蛋白等動物蛋白原料，以及黑米、菜籽、靈芝、枸杞等植物蛋白原料中均獲得了具有抗氧化作用的活性肽[6]。由此可見，生產抗氧化肽的原料范圍非常廣泛。

南瓜籽作為南瓜的副產品，來源廣泛，產量巨大，其榨油后的餅粕含有豐富的蛋白質[7]，直接廢棄造成資源的極大浪費。本實驗即利用酸性蛋白酶酶解南瓜籽蛋白制備抗氧化肽，同時應用響應面法[8-10]優化酶解工藝，為南瓜籽蛋白的充分利用和南瓜籽肽類產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜籽分離蛋白(總蛋白含量91.07%) 實驗室自制；酸性蛋白酶(固態，酶活力為10萬U/g pro以上) 寧夏和氏璧公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2800AH型紫外-可見分光光度計 龍尼柯(上海)儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；AL204電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TG16A-WS臺式高速離心機 湖南賽特湘儀離心機有限公司；868型pH測試儀 美國奧立龍公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除率的測定[11]

DPPH自由基清除率采用比色法，具體過程為：在反應管中加入2mL 0.2mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，再加入2mL 南瓜籽蛋白水解液，混合均勻，室溫條件下避光反應50min 后，于517nm 波長處測定吸光度。同時以2mL DPPH溶液與2mL 蒸餾水混合后的吸光度為對照組；以2mL 蒸餾水與2mL 乙醇混合后的吸光度為空白組。

式中：A1為加水解液后DPPH溶液的吸光度；A2為空白組的吸光度；A3為未加水解液時DPPH溶液的吸光度。

1.3.2 南瓜籽蛋白酶解液的制備

配制一定質量濃度的南瓜籽分離蛋白溶液，在沸水中加熱處理10min，冷卻至酶解反應的最適溫度，調節一定的pH值，然后按一定比例加入蛋白酶，反應過程中使pH值保持恒定。反應到預定時間，沸水浴滅酶10min，冷卻后5000r/min離心20min，上清液置于冰箱中待用。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 酶添加量的確定

配制底物質量濃度為0.05g/mL的南瓜籽蛋白溶液5份，調pH值為3.5，在溫度為50℃，加酶量分別為500、2000、4000、6000、8000U/g pro的條件下酶解4h。以DPPH自由基清除率為指標，確定較適的加酶量。

1.3.3.2 酶解溫度的確定

配制底物質量濃度為0.05g/mL的南瓜籽蛋白溶液5份，調pH值為3.5，在加酶量為6000U/g pro，溫度分別為30、40、45、50、55℃的條件下酶解4h。以DPPH自由基清除率為指標，確定酶解的較適溫度。

1.3.3.3 pH值的確定

配制底物質量濃度為0.05g/mL的南瓜籽蛋白溶液5份，在加酶量為6000U/g pro、溫度為50℃，pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5的條件下酶解4h。以DPPH自由基清除率為指標，確定酶解的較適pH值。

1.3.3.4 底物質量濃度的確定

分別配制底物質量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、 0.10g/mL的南瓜籽蛋白溶液，在pH值為2.5、加酶量為6000U/g pro、溫度為50℃條件下酶解4h。以DPPH自由基清除率為指標，確定酶解的較適底物質量濃度。

1.3.3.5 酶解時間的確定

配制底物質量濃度為0.05g/mL的南瓜籽蛋白溶液5份，調pH值為2.5，在加酶量為6000U/g pro、溫度為50℃的條件下分別酶解2、4、6、8、10h，測定酶解液的DPPH自由基清除率，確定較適的酶解時間。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，設計了N＝12 的Plackett-Burman篩選實驗，以DPPH自由基清除率為響應值Y，篩選出影響最顯著的3個因素即：加酶量、底物質量濃度、酶解時間，然后結合Box-Behnken中心組合試驗設計原理[16]，開展三因素三水平的響應面試驗。試驗共有15個試驗點，其中12個為分析因子，3個為零點，零點試驗進行3次，以估計誤差。試驗以隨機次序進行，重復3次。試驗設計見表1。

表1 響應面分析因素水平表Table 1 Factors and their coded levels teasted in response surface analysis

1.4 數據分析

采用軟件MINITAB15.0處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 加酶量對抗氧化活性的影響

圖1 加酶量對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on DPPH free radicalscavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

由圖1可知，南瓜籽蛋白酶解液對DPPH自由基的清除率隨著酶用量的增加而增強，當加酶量超過 6000U/g pro時，這種趨勢變得緩慢。這可能是由于加酶量小于6000U/g pro時，在底物質量濃度一定的情況下，增加的酶量未使底物質量濃度飽和，隨著加酶量的增大，反應速度越快，蛋白質水解度也越高，得到的多肽液清除DPPH自由基的能力越強。而當加酶量繼續增加時，底物質量濃度相對較低，酶分子過飽和，所以水解程度變化不大，活性多肽的量不再增加。同時，酶量的增加也會使生產成本大大增加，所以選擇酶用量為6000U/g pro較為合適。

2.1.2 溫度對抗氧化活性的影響

圖2 酶解溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on DPPH free radicalscavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

溫度對酶催化反應的影響是多方面的，溫度提高會影響酶的穩定性和底物轉化成產物的速度[12]。由圖2可知，50℃左右時南瓜籽蛋白酶解液表現出最強的DPPH自由基清除能力，這可能是因為隨著溫度的升高，酶促反應的速度加快，水解度增大，活性多肽的含量增加；當溫度高于50℃時，蛋白酶結構發生改變，酶活降低，使活性肽的含量保持在一定水平。因此較適宜的酶解溫度為50℃。

2.1.3 pH值對抗氧化活性的影響

圖3 pH值對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on DPPH free radicalscavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

pH值能影響酶活性部位的解離和底物蛋白的解離，從而直接影響了酶與底物蛋白的結合與催化,每個催化反應都有一個最適宜的pH值[13]，此外，不同的反應條件對酶解產物的結構、性質有著不同的影響，從而使產物表現出不同的清除DPPH自由基的活性[12]。由圖3可知，當pH值為2.5時酶解液的DPPH自由基清除能力最強，隨著pH值繼續升高，活性下降并逐漸趨于平緩。本實驗旨在得到活性高的多肽片段，因此選擇pH2.5作為較適pH值。

2.1.4 底物質量濃度對抗氧化活性的影響

圖4 底物質量濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on DPPH free radicalscavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

由圖4可知，隨著底物質量濃度的增大，酶解液的DPPH自由基清除率先增大后減小，在0.06g/mL左右達到最大。在低質量濃度時，溶液太稀不利于酶分子與蛋白質分子相互作用，而實際生產也希望底物質量濃度較大，獲得較多的活性多肽；但是質量濃度過高，溶液比較黏稠，也會阻礙酶與蛋白之間的充分作用[14]，故初步確定酶解體系的較適底物質量濃度為0.06g/mL。

2.1.5 酶解時間對抗氧化活性的影響

圖5 酶解時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on DPPH free radicalscavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

由圖5可知，從2～4h時，DPPH自由基清除率顯著增大，4h以后增加緩慢。由于在反應的初始階段，蛋白酶活力最強，能與底物充分結合，而且底物質量濃度最大，酶作用位點也最多，此時反應最快，酶解液活性顯著增加。隨著反應的繼續進行，底物質量濃度減少，反應位點相應減少，產物質量濃度增加，對酶催化反應起到抑制作用，反應達到某一動態平衡，同時酶活力也隨時間的延長而降低[15]。這些因素的綜合作用導致酶解液的活性增加趨于平緩，因此初步選擇較適酶解時間為4h。

2.2 酸性蛋白酶酶解南瓜籽蛋白的響應面試驗分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立及檢驗

酸性蛋白酶酶解南瓜籽蛋白的響應面分析試驗根據Box-Behnken設計進行了15組試驗，其中3組中心點重復試驗，結果見表2。利用Minitab15.0軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到編碼空間的酸性蛋白酶水解南瓜籽蛋白的三元二次回歸方程如下：

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design and results for response surface analysis

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the fitted regression model

從該模型的方差分析表3可知，本實驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(P＜0.0001)[16]。失擬項在α＝0.05水平上不顯著(P＝0.167＞0.05)，其決定系數為0.9918，校正決定系數為0.9770，說明該模型能解釋97.70%響應值的變化，僅有總變異的2.30%不能用此模型來解釋，說明該模型擬合程度良好，用該模型對酸性蛋白酶水解制備南瓜籽抗氧化肽的工藝進行優化是合適的。

表4 回歸系數顯著性分析Table 4 Significance test for each regression coefficient of the fitted regression model

對方程的回歸系數顯著性分析(表4)表明，試驗中常量、A、B、C、B2、C2這幾個因素對酶解液清除率的影響顯著，表明在酸性蛋白酶水解南瓜籽蛋白過程中，加酶量、酶解時間、底物質量濃度對DPPH自由基清除率有顯著影響：B2、C2的影響顯著也說明酶解過程中酶解時間和底物質量濃度對酶解液的抗氧化活性影響是非線性的。

2.2.2 響應面分析與優化[13]

通過上述二次多項回歸方程所作的響應曲面圖和等高線圖見圖6～8。通過該組動態圖即可對任何兩因素交互影響DPPH自由基清除率效應進行分析與評價，并從中確定最佳因素水平范圍。等高線的形狀反映出交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[17]。

圖6顯示了加酶量和酶解時間對DPPH自由基清除率的交互影響效應。從其等高線圖可以直觀的看出加酶量和酶解時間的交互作用不顯著，加酶量在4000～8000U/g pro之間，時間在4～6h之間存在最高值，DPPH自由基清除率最高值在91%～93%之間。圖7顯示了加酶量和底物質量濃度對DPPH自由基清除率的交互影響效應，加酶量在3000～8000U/g pro之間，底物質量濃度在0.04～0.06g/mL之間存在最高值，DPPH自由基清除率最高值在92%～96%之間。圖8顯示了底物質量濃度和酶解時間對DPPH自由基清除率的交互影響效應，由等高線圖可見，該兩因素對DPPH自由基清除率的交互作用比較顯著，當底物質量濃度約為0.045～0.06g/mL，酶解時間約為3～6h時，DPPH自由基清除率最高值在92%～96%之間。

圖6 加酶量和酶解時間交互影響DPPH自由基清除率的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of enzyme concentration and hydrolysis time on DPPH free radicals cavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

圖7 加酶量和底物質量濃度交互影響DPPH自由基清除率的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of enzyme concentration and substrate concentration on DPPH free radical scavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

圖8 底物質量濃度和酶解時間交互影響DPPH自由基清除率的響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of substrate concentration and hydrolysis time on DPPH free radical scavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

2.2.3 南瓜籽蛋白酶解工藝條件的確定及驗證

根據Box-Behnken試驗所得的結果和二次多項回歸方程，利用MINITAB15.0軟件獲得了DPPH自由基清除率最高時的最佳酶解條件為：酶解溫度5 0℃、pH2.5、酶解時間4.87h、底物質量濃度0.0543g/mL，加酶量6181.82U/g pro，在此酶解條件下，DPPH自由基清除率的預測值為93.17%。為了檢驗模型預測的準確性，在最佳酶解條件下進行酶解，考慮到操作的可行性，實際酶解條件修正為：溫度50℃、酶解pH 2.5、酶解時間5h、底物質量濃度0.05g/mL、加酶量6000U/g pro。

在以上優化條件下進行驗證實驗，共進行3次實驗，所得DPPH自由基清除率結果分別為92.15%、93.08% 和93.23%，平均值為92.82%，與預測值較為接近，證明該模型能較好地預測南瓜籽酶解液的實際DPPH自由基清除率效果。

3 結 論

本研究在單因素試驗的基礎上，運用Plackett-Burman篩選試驗結合Box-Behnken響應面設計確定加酶量、底物質量濃度、酶解時間三因素為顯著因素，并且優化得到酸性蛋白酶水解制備南瓜籽抗氧化肽的最佳酶解條件為加酶量6000U/g pro，底物質量濃度0.05g/mL、酶解時間5h、溫度50℃、pH2.5，在此酶解條件下，DPPH自由基清除率可達到92.82%。經方差分析得知酶解時間和底物質量濃度對DPPH自由基清除率的影響都是顯著的而且是非線性的，而它們之間的交互影響不顯著。實驗證明，響應面分析法可以有效地優化酶解制備南瓜籽抗氧化肽的工藝條件，這為進一步分離純化南瓜籽抗氧化肽提供了數據參考。

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Optimization of Preparation Process for Antioxidant Peptides from Pumpkin Seed by Response Surface Methodology

FAN San-hong，MAO Qiang-qiang ，WANG Ya-yun，FENG Yu-wei，LIU Yan-rong
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Pumpkin seed protein isolate was hydrolyzed by acidic protease to prepare antioxidant peptides. One-factor-at-atime experiments were done to explore the effects of enzyme concentration, pH, temperature, substrate concentration and hydrolysis time on the scavenging activity of pumpkin seed hydrolysate against DPPH free radicals. Enzyme concentration, susbstrate concentration and hydrolysis time were identified as main affecting parameters and optimized using response surface analysis based on a three-variable, three-level Box-Behnken design. The optimal hydrolysis conditions were determined as hydrolysis temperature of 50 ℃, hydrolysis pH of 2.5, enzyme concentration of 6000 U/g, substrate concentration of 0.05 g/mL and hydrolysis time of 5 h. Under these conditions, the scavenging activity of DPPH free radicals was up to 92.82%.

response surface methodology；pumpkin seed；antioxidant peptide；enzymatic hydrolysis；optimzation

TS255.36；TS218

A

1002-6630(2012)11-0241-06

2011-06-23

山西省科技攻關項目(20080311015)；山西省高等學校高新技術產業化項目(20111003)

范三紅(1963—)，男，副教授，碩士，研究方向為食品科學。E-mail：fsh729@sxu.edu.cn