人工接種發酵甘藍工藝條件的優化

燕平梅，趙文婧，宋敏麗，吳麗花，陳燕飛，張 騰

(太原師范學院生物系，山西 太原 030031)

人工接種發酵甘藍工藝條件的優化

燕平梅，趙文婧，宋敏麗，吳麗花，陳燕飛，張 騰

(太原師范學院生物系，山西 太原 030031)

為了探究甘藍人工接種發酵適宜的發酵劑及發酵條件，采用從四川泡菜老湯中分離的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)3種菌以單一和不同配比混合組合成16組組合發酵劑中選出發酵甘藍時亞硝酸鹽含量低、發酵速度快、風味好的發酵劑。結果表明：腸膜明串珠菌、戊糖乳桿菌，其質量比為1:2(nPb:SPc組合)，腸膜明串珠菌、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌，其質量比為1:1:1(nPb:bC1:SPc組合)，此兩種組合為較優化發酵劑。應用響應面分析法優化此兩種組合發酵劑接種發酵甘藍的工藝條件。人工接種發酵甘藍的條件為食鹽質量濃度4g/100mL、接種量0.2%、發酵溫度25℃。通過主效應分析說明食鹽質量濃度對總酸度影響最大，發酵溫度次之，接種量對其影響較小。

人工接種發酵；蔬菜；乳酸菌；響應面分析法

蔬菜自然發酵過程中，以乳酸菌的活動貫穿發酵的全過程。不同乳酸菌在發酵中呈現一定消長規律[1-3]。發酵初期主要是腸膜明串珠菌等異型發酵乳酸菌為主的發酵階段，此時它的數量多、且生長繁殖速度快，但是它對酸的敏感性較強，隨著發酵的進行很快死去，隨后短乳桿菌、植物乳桿菌成為發酵的優勢菌，快速生長繁殖產生大量乳酸，最后由耐酸的植物乳桿菌等同型發酵菌完成發酵。因此蔬菜發酵過程分發酵初期、中期、后期3個階段，發酵初期主要進行異型發酵，代謝產物有乳酸、醋酸、二氧化碳等，此時為產氣階段，發酵中期既有異型發酵、又有同型發酵，后期主要進行同型發酵，代謝產物主要為乳酸，是不產氣階段。

為了能更好地控制蔬菜發酵，人們在泡菜純種發酵生產方面進行了大量研究。一些研究者模擬自然發酵蔬菜過程中乳酸菌的消長變化規律，以異型乳酸菌和同型乳酸菌混合為發酵劑發酵蔬菜。生產中采用腸膜明串珠菌、短乳桿菌、植物乳桿菌的混合接種，最終產品質量與不接種生產的產品質量相比無太大變化[4-6]。但是，有時接種后的生產要優于未接種的生產[7-8]，有時相反。沈國華等[9]為異型發酵和同型發酵乳酸菌之間的恰當比例對生產優質泡菜是必需的[9]，但目前這一比例尚不清楚。沈國華等[9-10]進行了采用植物乳桿菌或干酪乳桿菌單加或以1:1的比例混合的蔬菜接種發酵。蔣和體[11]則認為植物乳桿菌與干酪乳桿菌為3:1比較合適。研究結果差異性存在的可能是由于蔬菜原料不同、處理方式不一樣、發酵條件不同，所選菌種不同所致。

本實驗以從四川泡菜老湯中分離的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)3種菌以單一和不同配比混合組合成16組組合的發酵劑發酵甘藍，通過測定發酵速度、產酸、亞硝酸鹽含量及感官評定選擇優良的發酵菌株的配比形式，作為甘藍發酵的發酵劑，并研究此發酵劑接種發酵甘藍的最適發酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍來自中國農業大學附近的菜市場。本實驗所用的乳酸菌是從四川泡菜老湯和泡菜鹵中分離所得，包括植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum，編號bC1)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus，編號SPc)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides，編號nPb)。

乳酸、醋酸(均為色譜純) 美國Sigma公司；對氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺(分析純) 北京化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

SCL-10AVP高效液相色譜儀、UVmini-1240紫外-可見分光光度計 日本島津公司；F-23 pH計 日本 Horiba有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵劑和接種發酵甘藍的制備

冰箱保存菌→轉接活化→擴大培養(30℃培養20h左右)→ 4000r/min離心5min → 稱質量

稱取50g沖洗干凈瀝干的甘藍，放入滅菌的三角瓶中，加入質量濃度5g/100mL食鹽水100mL煮沸涼到室溫，接入乳酸菌發酵劑，30℃培養箱中厭氧發酵。

1.3.2 發酵菌種組合

將3株菌種按表1接種到發酵甘藍中，于30℃條件下發酵，定期取發酵甘藍測亞硝酸鹽含量，取發酵菜汁測pH值和可滴定酸，并比較感官的不同。

表1 發酵劑篩選試驗處理Table 1 Single strains and their combinations

1.3.3 發酵甘藍中亞硝酸鹽和可滴定酸的測定

可滴定酸的測定：由0.1mol/L氫氧化鈉滴定，酚酞為滴定終點指示劑[12]；泡菜鹵pH值測定：用數字pH計，pH計的校準用廠商供給的pH值為4.0和7.0的標準緩沖溶液；亞硝酸鹽的測定：按GB/T 5009.33—1996《食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定方法》測定[13]。

1.3.4 乳酸和醋酸相對比值的測定

采用HPLC法：色譜系統包括：LC-10AT溶劑輸送泵、SPD-10AVVP紫外檢測器、CTO-10AVVP柱溫箱、DG12A自動脫氣機、SCL-10AV系統控制器、C-R8A積分儀。

色譜條件：色譜柱：Lichrosper 100RP-18(4.6mm×25cm，5μm)；流動相：0.5%磷酸氫二銨；流量：1mL/min；檢測波長：214 nm；柱溫：4 0℃；進樣量：20μL；分析時間：10min。

1.3.5 感官指標評定

綜合評分時，按加權系數：顏色25%、滋味25%、香氣25%、質地25%，滿分100(表2)，每次評分請消費者10人，實驗前不接觸或避免使用有氣味的化妝品、洗滌劑，避免感受器官受強烈刺激，于實驗區對發酵甘藍作出評價。記錄數據分析，判斷處理間差異顯著性。

1.3.6 發酵條件對發酵甘藍pH值和可滴定酸的影響

1.3.6.1 不同溫度條件下發酵劑發酵甘藍實驗

篩選出的兩組優良發酵劑以0.10%的接種量接入到質量濃度4g/100mL食鹽的發酵甘藍中，分別于15、20、25、37℃溫度條件下發酵，定期取甘藍鹵測pH值和可滴定酸。

表2 甘藍發酵產品感官指標評分標準Table 2 Standards for sense evaluation of fermented cabbage

1.3.6.2 不同接種量對發酵速度的影響

以nPb:SPc組合為接種材料，以不同的接種量接種到質量濃度4g/100mL食鹽的發酵甘藍中，于25℃發酵，定期測發酵菜液的pH值和可滴定酸度。從經濟和發酵速度考慮選擇合適的接種量。

1.3.6.3 不同質量濃度食鹽對發酵的影響

以nPb:SPc組合為接種材料，接種量為0.10%，取不同質量濃度食鹽的發酵甘藍于25℃發酵，定期測發酵菜液的亞硝酸鹽含量。從發酵蔬菜的安全性和和發酵速度考慮選擇合適的鹽質量濃度。

1.3.7 發酵條件的優化試驗及最佳發酵模式的建立

表3 三因素二次正交旋轉回歸試驗設計Table 3 Factor and levels of quadratic orthgonal rotary regression design

采用響應面分析法，因素水平編碼見表3。在單因素試驗基礎上，以發酵甘藍的總酸度為指標，以發酵溫度、接種量、食鹽質量濃度3個因素為自變量，設計三因素三水平共15個試驗點的響應面分析試驗，優化人工接種發酵甘藍的工藝條件。

1.3.8 統計分析方法

采用SAS 8.0軟件進行方差分析和中心組合設計分析。

表4 不同菌種組合的發酵劑接種發酵甘藍總酸變化情況Table 4 Total acidity changes in fermented cabbage brine during fermentation

2 結果與分析

2.1 優良發酵劑的篩選

2.1.1 不同菌種組合發酵甘藍亞硝酸鹽含量的變化

圖1 菌種組合1～8發酵甘藍菜中亞硝酸鹽含量的變化Fig.1 Change in nitrite concentration in fermented cabbage during fermentation

圖2 菌種組合9～16發酵甘藍菜中亞硝酸鹽含量的變化Fig.2 Change in nitrite concentration in fermenting cabbage during fermentation

圖1 、2表示16組發酵劑發酵甘藍中亞硝酸鹽含量變化情況，組合2和組合3發酵甘藍菜中亞硝酸鹽含量較其他組合高，組合1在發酵初期亞硝酸鹽含量較低，而發酵第5天亞硝酸鹽含量較其他組合高。因此，從亞硝酸鹽含量高低考慮，組合1～3這3種單一菌種不適宜作發酵劑。組合4～16為混合菌種發酵劑，發酵甘藍菜中亞硝酸鹽含量較組合1～3單一菌種低，組合7、14、15、16發酵甘藍亞硝酸鹽含量較其他混合組合高，未被作為發酵劑的候選對象。

2.1.2 不同菌種組合發酵甘藍產酸和pH值變化情況

由表4可知，單一菌組合1～3發酵初期，pH值下降較混合菌組慢，產酸慢。中、后期pH值和總酸度變化情況與混合菌組合無明顯差異。說明混合菌啟動發酵的作用強于單一菌種。含nPb菌的組合發酵初期 pH值下降速度較快，產酸較快，中、后期與不含nPb菌的組合無明顯的區別，說明nPb乳酸菌在初期生長旺盛，對發酵產酸起重要作用。

表5 不同菌種組合的發酵劑接種發酵甘藍產酸情況和品質比較Table 5 Acid production and sensory quality of fermented cabbage

由表5可知，單一菌種發酵時，球菌(nPb)較桿菌(bC1和SPc)產酸少，但前者風味明顯優于后者。這與Stamer等[14]使用單一純乳酸菌發酵生產的酸菜汁風味研究的結果一致。混合菌種為發酵劑時，含球菌(nPb)較不含nPb產酸少，而風味好。含球菌(nPb)混合菌種發酵較單一菌種發酵風味柔和、醇厚豐滿。

16組不同菌種組合發酵10d后取發酵甘藍鹵用高效液相色譜分離測定乳酸和醋酸，求其含量比值。結果見表6。蔬菜發酵過程中，以乳酸發酵為主，同時伴有微量醋酸的生成。極少量的醋酸不但無損于腌制品的風味，反而有利于風味的提高，如果醋酸含量過高，會影響制品的風味。乳酸、醋酸與乙醇生成具有芳香氣味的酯類物質，給發酵菜增添特有的香味和滋味。發酵過程中乳酸的產量及乳酸與醋酸含量的比值是影響發酵蔬菜風味的重要因素。李基銀[15]認為酸度在0.45%～0.8%左右，乳酸與醋酸含量比值在4:1～10:1之間，發酵菜風味好。本實驗16組發酵劑中組合8和13發酵甘藍鹵中乳酸與醋酸含量比小于10。其他組合是乳酸含量遠遠大于醋酸，其味道酸中帶臭。

考慮到亞硝酸鹽含量、產酸量及風味因素，最終選組合8和13為優良發酵劑，這兩種發酵劑是異型發酵乳酸菌與同型發酵乳酸菌的不同配比。

表6 泡甘藍鹵中乳酸與醋酸含量的比值Table 6 Lactic acid-to-acetic acid ratio in fermented cabbage brine

2.2 接種發酵條件的優化

2.2.1 不同溫度下優良發酵劑發酵甘藍產酸情況

發酵劑組合8、13在不同溫度條件下發酵甘藍，pH值和總酸度的變化快慢不一樣，在15、20、25、37℃發酵條件下，組合8到達發酵成熟的時間(pH值為3.5)[9]分別為5、3、2、2d。 組合13到達發酵成熟的時間分別為5、3、2、1 d。說明發酵溫度越高，達到發酵成熟的時間愈短。反之，發酵溫度愈低，到達成熟的時間愈長。溫度高的優點為發酵快、生產周期短。缺點是發酵過程難以控制，容易出現過酸，并有異味，雜菌生長旺盛，變味腐敗等問題，質量不穩定，風味較差。發酵溫度低，不會出現過熟、污染雜菌等現象，且風味好。但發酵速度慢，生產周期長，經濟效益低下。為了兼顧產品的品質和效益，選擇25℃左右為發酵甘藍合適溫度。

2.2.2 不同接種量對發酵甘藍產酸和pH值的影響

以nPb:SPc 組合的發酵劑以不同的接種量接入甘藍中發酵，從結果可知，接種量對發酵的影響很大，接種量高，發酵速度快，產酸多。0.05%和0.1%的接種量甘藍需2d成熟，0.2%和0.35%的接種量，1d就能成熟。考慮到發酵的速度和經濟性，以最大限度地使發酵技術的優勢得以發揮，接種量為0.2%左右為最佳選擇。

2.2.3 不同食鹽質量濃度對接種發酵甘藍亞硝酸鹽含量的影響

從nPb:SPc組合為接種材料甘藍在不同質量濃度的食鹽發酵過程中產生的亞硝酸鹽量都有一個高峰期，且高峰期和峰值隨食鹽質量濃度和蔬菜的種類不同而異。結果表明甘藍發酵過程中，食鹽質量濃度低，“亞硝酸鹽峰”出峰早，峰值大；食鹽質量濃度高，“亞硝酸鹽峰”出峰晚，峰值小。在2g/100mL食鹽發酵條件下，“亞硝酸鹽峰”出現在第1天，其值為37mg/kg，用4g/100mL食鹽發酵條件下，“亞硝酸鹽峰”出現在第2天，其值為23mg/kg，用6g/100mL食鹽發酵條件下，“亞硝酸鹽峰”出現在第3天，其值為11mg/kg。而且，高質量濃度的食鹽比低質量濃度的食鹽發酵甘藍中亞硝酸鹽含量降低的速度慢。從發酵甘藍的亞硝酸鹽含量和其降低的速度考慮選擇4g/100mL的食鹽。

2.2.4 nPb:SPc組合發酵模型的建立和統計分析

為了研究不同條件對人工發酵甘藍的影響和確定最佳的發酵條件，以nPb:SPc組合為接種材料在單因素試驗基礎上進行中心組合試驗，對工藝參數進行優化，試驗設計方案和結果見表7，15個試驗點分為兩類：其一是析因點，自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維定點，共有12個析因點；其二是零點，為區域中心點，零點試驗重復5次，用來估計試驗誤差。

以甘藍發酵3d的pH值(Y1)和總酸度(Y2)為響應值，經回歸擬合后，得到回歸方程：

表7 三因素二次正交旋轉回歸試驗設計試驗及結果Table 7 Box-Behnken design arrangment and results

表8 pH值為指標的回歸方程各項的方差分析表Table 8 Variance analysis for pH value

表9 以總酸度為指標的回歸方程各項的方差分析表Table 9 Variance analysis for total acidity

由表8、9可知，結合回歸方程的方差分析中的失擬項均方和純誤差均方，對pH值回歸方程的失擬性檢驗F1＝50.65903＞F0.05(3,2)＝19.2，說明差異顯著，方程(1)對所有試驗點擬合程度較差。總酸度回歸方程失擬性檢驗F2＝17.66813＜F0.05(3,2)＝19.2，差異不顯著，失擬性檢驗不顯著，說明總酸度回歸方程對所有試驗點擬合程度較好。所以對總酸度回歸方程進行顯著性檢驗。用回歸方程來描述總酸度與自變量的關系時，其非線性關系顯著：F1＝13.15608＞F0.05(9,5)＝10.2，差異顯著，總酸度回歸方程均通過F1、F2檢驗，說明由二次正交旋轉設計所獲得的模型能夠反映實際規律是有效的。由酸度回歸方程可知，一次項回歸系數絕對值的大小依次為X3＞X1＞X2，說明食鹽質量濃度對總酸度影響最大，發酵溫度次之，接種量對其影響較小。

2.2.5 交互作用對人工接種nPb:SPc組合發酵甘藍總酸度的影響

由圖3可知，在溫度一定時，隨著接種量增加，總酸度先增加后減少。當接種量一定時，隨著發酵溫度增高，總酸度先增加后減少。適當發酵溫度和接種量獲得較高的總酸度。由圖4可知，接種量(X2)較低時，隨著發酵用食鹽質量濃度增加，總酸度增大，接種量(X2)較高時，隨食鹽質量濃度增大，總酸度先高后低。用鹽量(X3)較少時，接種量(X2)加大，總酸度隨之增高，用鹽量(X3)較高時，隨著接種量的增大，而總酸度(Y2)減少。較高的接種量和較低的用鹽量可以得到較高的總酸度。由圖5可知，食鹽質量濃度(X3)一定時，發酵溫度(X1)增高，發酵總酸度先增加后減少，發酵溫度較中心值偏低時，發酵總酸度增加，發酵溫度較中心值偏高時，發酵總酸度減少。發酵溫度不變時，食鹽質量濃度增加，總酸度增大。較低的發酵溫度和適當的食鹽質量濃度可獲得較高的總酸度。

圖3 發酵溫度與接種量對總酸度的影響Fig.3 Response surface and contour plots of total acidity (Y2) vs. fermentation temperature (X1) and inoculums size (X2)

圖4 接種量與食鹽質量濃度對總酸度的影響Fig.4 Response surface and contour plots of total acidity (Y2) vs. inoculums size (X2) and salt concentration (X3)

圖5 發酵溫度與食鹽質量濃度對總酸度的影響Fig.5 Response surface and contour plots of total acidity (Y2) vs. fermentation temperature (X1) and salt concentration (X3)

2.2.6 優化發酵條件的驗證

經3次驗證，實驗所得的總酸度平均值為0.51%，與預測值的總酸度0.52%接近，據報道[16]發酵菜的總酸度為0.5%～0.6%是適合人們的口感，表明本實驗采用響應面優化的發酵條件可靠。

3 結 論

本實驗以從泡菜老湯和泡菜鹵中分離的乳酸菌，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)這3種菌不同比例組合的16種組合接種發酵甘藍，從發酵制品亞硝酸鹽含量、產酸量及風味因素，最終選腸膜明串珠菌、戊糖乳桿菌組合，接種質量比例為1:2和腸膜明串珠菌、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌組合，接種質量比例為1:1:1為優良發酵劑。

應用響應面分析法分析人工接種發酵甘藍的條件，以總酸度建立數學模型，結合回歸方程的方差分析，結果表明：以pH值為指標的回歸方程對所有試驗點擬合程度較差。說明總酸度回歸方程對所有試驗點擬合程度較好。所以以總酸度為測試指標驗證發酵了條件。關于pH值擬合程度較差原因有待于進一步的研究。

應用響應面分析法優化了人工接種發酵甘藍的條件，影響甘藍發酵酸度的主要因素為食鹽質量濃度，次要因素為發酵溫度和接種量；發酵的適宜條件為食鹽4g/100mL、接種量0.2%、發酵溫度25℃。

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Optimization of Cabbage Fermentation Using Starter Culture

YAN Ping-mei，ZHAO Wen-jing，SONG Min-li，WU Li-hua，CHEN Yan-fei，ZHANG Teng
(Department of Biology, Taiyuan Normal University, Taiyuan 030031, China)

The purpose of this study was to develop a fermentation strater culture and to optimize the fermentation conditions for fermented cabbage production. In this study, 16 strains including single strains of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus and Leuconostoc mesenteroides isolated from Sichuan pickles and their combinations were first tested. Two different strain combinations were then selected out of them based on fermentation speed, nitrite content and fermented cabbage flavor for the optimization of fermentation by response surface methodology. The results showed that the optimal condition for cabbage fermentation by a mixture of Leuconostoc mesenteroides and Lactobacillus pentosus (1:2) or Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus pentosus, and Lactobacillus plantarum(1:1:1) were 4 g/100 mL salt, 0.2% of inoculum size and 25 ℃ of fermentation temperature. Main effect analysis showed that salt concentration had the greatest effect on total acidity of fermented cabbage, followed by fermentation temperature and then inoculums size.

inoculated fermentation；vegetables；lactic acid bacteria；response surface analysis

TS255

A

1002-6630(2012)11-0224-07

2011-10-13

國家自然科學基金面上項目(31171743)

燕平梅(1968—)，女，副教授，博士，研究方向為食品科學與食品微生物學。E-mail：yanpingmei@sohu.com