液基夾層杯技術(shù)用于基層實(shí)驗(yàn)室結(jié)核病診斷的可行性研究

宋紅煥 季明 唐國(guó)鋒 朱瑋 朱澄玉 陳誠(chéng) 許衛(wèi)國(guó) 陸偉

液基夾層杯技術(shù)用于基層實(shí)驗(yàn)室結(jié)核病診斷的可行性研究

宋紅煥 季明 唐國(guó)鋒 朱瑋 朱澄玉 陳誠(chéng) 許衛(wèi)國(guó) 陸偉

目的評(píng)價(jià)液基夾層杯法在基層實(shí)驗(yàn)室用于結(jié)核病診斷的可行性及安全性>。方法在泰興、江陰CDC兩個(gè)縣級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，對(duì)385例疑似肺結(jié)核患者的754份痰標(biāo)本同時(shí)采用液基夾層杯法與直接痰涂片法進(jìn)行鏡檢，結(jié)合臨床診斷，比較2種方法的陽性檢出率。采用四格表Fisher確切概率法進(jìn)行比較，并進(jìn)一步比較兩種方法對(duì)不同性狀、不同時(shí)間收集的痰標(biāo)本的陽性率。選取12份陽性痰標(biāo)本，設(shè)定不同的痰消化液比例，不同的消化時(shí)間，加熱與否處理痰標(biāo)本，將處理后的消化液接種到羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，通過比較生長(zhǎng)情況評(píng)價(jià)液基法的安全性>。結(jié)果液基夾層杯法、直接痰涂片法對(duì)754份痰標(biāo)本的陽性檢出率分別為23.5%（177／754）、16.8%（127／754），檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝48.02，P＝0.000）；比較不同性狀、不同時(shí)間采集的痰標(biāo)本采用兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，得出膿痰直涂法陽性檢出率為40.9%（81／198），液基法陽性檢出率為47.5%（94／198），兩種方法對(duì)于膿痰的檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher確切概率法，P確切概率＜0.001）；非膿性痰（包括血痰、黏液痰、口水痰）直涂法陽性檢出率為4.7%（9／193），液基法陽性檢出率為13.5%（26／193），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P確切概率值均＜0.001）。安全性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)消化液處理的痰標(biāo)本，培養(yǎng)8周后未見結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)>。結(jié)論液基夾層杯法提高了疑似肺結(jié)核患者細(xì)菌學(xué)檢查的陽性檢出率，且操作簡(jiǎn)單、安全性高，適合在基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用并便于開展質(zhì)量控制，是一種很有推廣價(jià)值的檢測(cè)方法。

結(jié)核，肺／診斷； 分枝桿菌，結(jié)核； 痰； 細(xì)菌學(xué)技術(shù)； 可行性研究

結(jié)核病是一種長(zhǎng)期危害人類健康的重大傳染病之一，我國(guó)是全球僅次于印度的第二大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，對(duì)結(jié)核病做出快速、準(zhǔn)確的診斷一直是結(jié)核病控制工作中的難點(diǎn)。目前，我國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室主要檢查方法是直接痰涂片鏡檢（簡(jiǎn)稱“直涂法”），該方法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，但靈敏度低；而傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法周期較長(zhǎng)（4～8周），目前最快的液體培養(yǎng)也需要10d左右，并且在痰標(biāo)本前處理及后期培養(yǎng)過程中可能導(dǎo)致Mtb死亡，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。此外，部分實(shí)驗(yàn)室也采用傳統(tǒng)的集菌法進(jìn)行檢測(cè)，但也存在操作過程繁瑣、安全性不高等問題。如何研發(fā)、推廣應(yīng)用結(jié)核病病原體快速檢測(cè)新技術(shù)是目前世界衛(wèi)生組織、國(guó)內(nèi)外結(jié)核病控制機(jī)構(gòu)和組織所共同致力的研究工作。本研究探討了國(guó)家科技重大專項(xiàng)研究的結(jié)核病診斷新技術(shù)——液基夾層杯法抗酸桿菌檢驗(yàn)技術(shù)（簡(jiǎn)稱“液基法”）在基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的可行性，參照國(guó)際結(jié)核病診斷新技術(shù)的評(píng)價(jià)方法，進(jìn)行了驗(yàn)證評(píng)價(jià)。

資料和方法

一、一般資料

1.資料來源：按照項(xiàng)目要求，收集艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)（2009ZX10004-904）示范區(qū)江蘇省泰州市泰興市CDC結(jié)核病門診及無錫市江陰市CDC結(jié)核病門診2010年1月至8月初診疑似肺結(jié)核病患者385例，其中男性261例，女性124例，平均年齡（49.12±18.77）歲，年齡最小的20歲，年齡最大的90歲。每位患者按要求分別采集即時(shí)痰、夜間痰、次日晨痰3份痰標(biāo)本，將符合要求的754份痰標(biāo)本（標(biāo)本量＞2ml）同時(shí)采用直涂法及液基法檢測(cè)Mtb。選取泰興項(xiàng)目點(diǎn)分析不同性狀痰標(biāo)本兩種方法檢測(cè)的陽性率，泰興項(xiàng)目點(diǎn)共收集痰標(biāo)本391份，其中口水痰29份、血痰12份、黏液痰152份、膿痰198份。所有入選患者的診斷均符合《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南（2008版）》［1］規(guī)定的疑似肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)分別在兩個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)進(jìn)行。

385例患者共收集痰標(biāo)本1155份，其中401份標(biāo)本因標(biāo)本量太少（＜2ml）無法滿足此研究方法的要求，最終有754份標(biāo)本納入本研究，其中即時(shí)痰332份，夜間痰288份，次日晨痰134份；泰興391份，江陰363份；選取泰興項(xiàng)目點(diǎn)收集的痰標(biāo)本分析兩種方法用于不同性狀痰標(biāo)本檢測(cè)陽性率的比較，膿痰198份，非膿性痰（血痰、黏液痰、口水痰）193份。

2.試劑和儀器：液基法所用試劑及儀器均由湖南天騎醫(yī)學(xué)新技術(shù)有限公司提供：TQ212型自動(dòng)離心涂片機(jī)、彭氏杯為湘藥管械（準(zhǔn)）字2005第2410002；其專利號(hào)分別為200420036036.7、200520049875.7。消化液注冊(cè)號(hào)：湘（懷）食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2005第1410005號(hào)。KP21型快速干片機(jī)、抗酸桿菌自動(dòng)閱片計(jì)算機(jī)報(bào)告系統(tǒng)及抗酸染液試劑盒。羅氏培養(yǎng)基由江蘇省CDC結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室制備。

二、方法

（一）項(xiàng)目實(shí)施情況

項(xiàng)目實(shí)施分為預(yù)實(shí)驗(yàn)階段和驗(yàn)證階段。預(yù)實(shí)驗(yàn)階段為期1個(gè)月，實(shí)驗(yàn)人員按照項(xiàng)目要求，同時(shí)采用直涂法和液基法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理，目的在于使實(shí)驗(yàn)室人員熟悉項(xiàng)目的各項(xiàng)要求，并熟練掌握液基法的操作流程，為后期項(xiàng)目順利開展提供良好的基礎(chǔ)。預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，泰興、江陰兩個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)的全部直涂法涂片和液基法涂片由泰州市CDC結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)核。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，由江蘇省CDC結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室對(duì)2個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)進(jìn)行考核，復(fù)核及考核結(jié)果合格后進(jìn)入驗(yàn)證階段，預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不納入統(tǒng)計(jì)范圍，在驗(yàn)證階段，采用的質(zhì)量控制方式為泰州市CDC對(duì)2個(gè)點(diǎn)每個(gè)月隨機(jī)抽取30%的痰涂片進(jìn)行復(fù)核，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并解決項(xiàng)目運(yùn)行中產(chǎn)生的問題。具體方式為：每個(gè)月末統(tǒng)計(jì)兩個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室登記本該月的痰涂片總數(shù)，按照比例計(jì)算總抽片數(shù)，計(jì)算間隔＝痰涂片總數(shù)／總抽片數(shù)，按照此間隔隨機(jī)進(jìn)行抽片。痰涂片質(zhì)量控制參照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃——痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》［2］進(jìn)行。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.直涂法：按《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃——痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》［2］進(jìn)行涂片、染色、鏡檢和記錄結(jié)果。

2.液基法：具體操作按照說明書進(jìn)行。

3.液基法安全性試驗(yàn)：液基法檢測(cè)樣本時(shí)首先采用標(biāo)本消化液對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行處理，消化液的主要成分為含氯消毒劑，其作用主要為消化痰液，釋放分枝桿菌；本方法檢測(cè)時(shí)，除消化外的其他步驟均在生物安全柜外進(jìn)行，故消化液的性能直接影響方法的安全性。本次實(shí)驗(yàn)選取直涂法結(jié)果4＋的痰標(biāo)本12份，每份標(biāo)本約2ml進(jìn)行液基法安全性試驗(yàn)，設(shè)定不同的痰消化液比例（1∶1，1∶2），不同的消化時(shí)間（5、10、15min），加熱與否處理痰標(biāo)本，將處理后的消化液接種到羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況。

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Microsoft excel錄入數(shù)據(jù)，配對(duì)資料采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)和確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)，SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

385例患者中直涂法檢出涂陽患者64例，液基法檢出88例；在754份痰標(biāo)本中液基法檢出陽性片177張，陽性率23.5%，直涂法檢出陽性涂片127張，陽性率為16.8%。比較兩種方法的陽性檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝48.02，P＝0.000），對(duì)直涂法陰性，液基法陽性的24例患者做進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，臨床診斷均為涂陰肺結(jié)核患者。

二、不同性狀痰標(biāo)本陽性檢出率比較

選取泰興項(xiàng)目點(diǎn)收集的痰標(biāo)本分析兩種方法用于不同性狀痰標(biāo)本檢測(cè)陽性率的比較，得出膿痰直涂法陽性檢出率為40.9%（81／198），液基法陽性檢出率為47.5%（94／198），兩種方法對(duì)于膿痰的檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher確切概率法，P確切概率＜0.001）；非膿性痰（包括血痰、黏液痰、口水痰）直涂法陽性檢出率為4.7%（9／193），液基法陽性檢出率為13.5%（26／193），兩種方法對(duì)于非膿性痰的檢測(cè)結(jié)果差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher確切概率法，P確切概率＜0.001）。

三、不同時(shí)間收集痰標(biāo)本陽性檢出率比較

其中即時(shí)痰采用直涂法與液基法兩種方法陽性檢出率分別為15.1%（50／332）、20.5%（68／332）；夜間痰為17.0%（49／288）、25.7%（74／288）；次日晨痰為20.9%（28／134），26.1%（35／134），檢測(cè)結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P確切概率值分別為＜0.001、＜0.001、＜0.05）。

四、液基法安全性試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)加入1～2倍于標(biāo)本的標(biāo)本消化液，混勻后，不管加熱與否，放置5～15min，接種于羅氏培養(yǎng)基上。37℃，培養(yǎng)8周后均未見Mtb生長(zhǎng)（表1）。

討 論

液基法為一種新型的集菌技術(shù)，與直涂法相比本質(zhì)上是一樣的。目前我國(guó)大多數(shù)縣級(jí)基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室仍采用直接涂片－抗酸染色技術(shù)作為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的主要技術(shù)，該技術(shù)操作過程簡(jiǎn)單、快速、成本低，但是靈敏度不高，有研究表明痰涂片檢測(cè)診斷肺結(jié)核的靈敏度為20%～80%［3－5］，容易造成漏診。液基夾層杯技術(shù)是對(duì)該方法進(jìn)行改良和創(chuàng)新的基礎(chǔ)上形成的，不僅保留了直涂法快速、直觀、費(fèi)用低的特點(diǎn)，而且還具有陽性檢出率高、安全性高、標(biāo)準(zhǔn)化程度高等直涂法所不具備的優(yōu)勢(shì)。

表1 液基法安全性試驗(yàn)結(jié)果

液基法技術(shù)的創(chuàng)新主要體現(xiàn)在離心集菌、消化液處理痰標(biāo)本方面，其作用主要有以下2個(gè)方面：一是徹底消化痰液、細(xì)胞，完全釋放 Mtb；二是滅活Mtb，保障后期操作的生物安全，然后通過加熱、高速離心，將釋放出來已滅活的Mtb集聚到彭氏夾層杯底部的基片上，再進(jìn)行染色鏡檢，其操作與直涂法基本一致。基于此創(chuàng)新點(diǎn)，該技術(shù)有陽性率高及安全性高的優(yōu)勢(shì)，本研究亦證實(shí)了這一點(diǎn)。

本研究中液基法對(duì)754份痰標(biāo)本的陽性檢出率為23.5%，直涂法為16.8%；比較兩個(gè)方法的陽性檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義 （χ2＝48.02，P＜0.001）。分析不同性狀痰標(biāo)本兩種方法檢測(cè)結(jié)果的陽性率，得出膿性痰直涂法陽性檢出率為40.9%，液基法陽性檢出率為47.5%，非膿性痰直涂法陽性檢出率為4.7%，液基法陽性檢出率為13.5%；由數(shù)據(jù)可以看出，非膿性痰采用液基法，相對(duì)陽性檢出率提高水平比膿性痰更為明顯。筆者分析不同時(shí)間采集的痰標(biāo)本采用兩種方法的陽性檢出率，其中即時(shí)痰采用兩種方法陽性檢出率分別為15.1%、20.5%；夜間痰分別為17.01%、25.60%；次日晨痰為分別20.9%、26.1%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)直涂法陰性、液基法陽性的24例疑似患者作進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：臨床最終診斷均為涂陰患者；另外有研究表明以培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，液基法診斷的靈敏度高于直涂法［6］，表明液基法在一定程度上提高了傳染性結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)率，對(duì)于結(jié)核病的防治工作有著重要的意義。

綜上所述，液基法推薦的痰標(biāo)本消化操作流程可以滿足生物安全的要求。同時(shí)液基法可以批量處理標(biāo)本，可以確保多個(gè)標(biāo)本處理的一致性。此外標(biāo)本收集、保存、用量可完全量化控制；標(biāo)本消化、離心涂片、染色可量化操作；染色加溫時(shí)的溫度和時(shí)間可準(zhǔn)確設(shè)定，整個(gè)過程便于標(biāo)準(zhǔn)化，保證了痰涂片的制備質(zhì)量［7］。說明液基夾層杯法在基層實(shí)驗(yàn)室用于結(jié)核病診斷有一定的推廣價(jià)值。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心.中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南（2008年版）.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009：20-27.

［2］趙雁林，姜廣路.中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃——痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè).北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009：7-14.

［3］Behr MA，Warren SA，Salamon H，et al.Transmission ofMycobacterium tuberculosisfrom patients smear-negative for acid-fast bacilli.Lancet，1999，353（9151）：444-449.

［4］Grzybowski S，Barnett GD，Styblo K.Contacts of cases of active pulmonary tuberculosis.Bull Int UnionTuberc，1975，50（1）：90-106.

［5］Urbanczik R.Present position of microscopy and of culture in diagnostic mycobacteriology.Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg A，1985，260（1）：81-87.

［6］楊華林，譚云洪，白麗瓊，等.液基夾層杯技術(shù)檢測(cè)抗酸桿菌應(yīng)用性研究.中國(guó)防癆雜志，2011，32（5）：279-282.

［7］王改，曹青山，王金繩，等.夾層杯集菌離心涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌對(duì)肺結(jié)核診斷價(jià)值的研究.中國(guó)民康醫(yī)學(xué)，2007，19（8）：614.

Feasibility study of the Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique on diagnosis of tuberculosis in primary level labo-ratory

SONG Hong-huan＊，JI Ming，TANG Guo-feng，ZHU Wei，ZHU Cheng－yu，CHEN Cheng，XU Wei-guo，LU Wei.＊Chronic Infection Prevention，Jiangsu Center for Disease Control and Prevention，Nanjing210009，China Correspondingauthor：LU Wei，Email；jsjkmck＠163.com

ObjectiveTo evaluate the feasibility and security of Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique used for diagnosis of tuberculosis in primary level laboratory.MethodsIn two primary level laboratories of Taixing and Jiangyin Center for Disease Control and Prevention，754sputum samples from 385suspect TB patients were tested simultaneously by two methods：sputum smear and acid-fast staining microscopy examination （direct AFB）and Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique.According to clinical diagnosis，the positive rates of the two methods for the sputum samples with different traits or collected at different times were compared by Fisher probabilities in 2×2table.12bacterium-positive sputa were treated with different proportion of digestion liquid，different digestion time，and heating or not.Then the digestive sputa were inoculated at Roche medium at 37℃.The security of the liquid-based method was evaluated by preparing the growth of mycobacteria. Results The positive rates of Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique and the direct AFB were 23.5% （177／754）and 16.8%（127／754）respectively，which had significant difference（χ2＝48.02，P＝0.000）.The positive rates of these two methods in purulent sputa were 47.5% （94／198）and 40.9% （81／198），which had significant differences（P＜0.001）.The positive rates for the non-purulent sputa（including bloody sputa，mucus sputa and saliva sputa）were 13.5% （26／193）and 4.7% （9／193）（P＜0.001）.The sputum samples treated with the digestive liquid were not found the growth of Mycobacteria after the culture for 8weeks. Conclusion Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique can improve the positive detection rate in suspect TB patients.It is simple，safe，and suitable for the application at primary laboratory for the diagnosis of tuberculosis and convenient for quality control.

Tuberculosis，pulmonary／diagnosis； Mycobacterium，tuberculosis； Sputum； Bacteriological techniques； Feasibility studies

“十一五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2009ZX10004-904）

210009，南京，江蘇省疾病預(yù)防控制中心慢性傳染病防制所 （宋紅煥、陳誠(chéng)、許衛(wèi)國(guó)、陸偉）；泰興市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防制科（季明、朱瑋）；江陰市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防制科（唐國(guó)鋒、朱澄玉）

陸偉，Email：jsjkmck＠163.com

2012-01-10）

（本文編輯：張曉進(jìn)）