miR-222與MBD2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

黃建軍 戈立東△ 周秀田 謝金龍 胡正超 周波 許威華

1.解放軍第169醫(yī)院腫瘤科，△病理科，湖南 衡陽 421002；2.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001

miR-222與MBD2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

黃建軍1戈立東1△周秀田2謝金龍1胡正超1周波1許威華1

1.解放軍第169醫(yī)院腫瘤科，△病理科，湖南 衡陽 421002；2.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001

背景與目的：MicroRNAs是一類19～25 bp內(nèi)源非編碼的小分子RNA，通過靶向抑制基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。本文旨在探討miR-222與甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白2(methyl-CpG binding domain protein 2，MBD2)在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法：收集2008年1月—2010年6月結(jié)腸癌患者手術(shù)標(biāo)本76例，癌旁組織作為正常對(duì)照，分別運(yùn)用原位雜交、免疫組化檢測結(jié)腸癌組織及癌旁組織中miR-222、MBD2的表達(dá)水平，分析其與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：原位雜交檢測顯示，在76例結(jié)腸癌組織中miR-222陽性表達(dá)率為92.1%，與癌旁對(duì)照組28.9%相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；光密度值檢測發(fā)現(xiàn)，miR-222的表達(dá)隨著結(jié)腸癌臨床分期的演進(jìn)而增加，且結(jié)腸癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的miR-222的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.01)；免疫組化結(jié)果顯示，在76例結(jié)腸癌組織中MBD2蛋白陽性表達(dá)率為19.7%，與癌旁對(duì)照組81.6%相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；光密度值檢測發(fā)現(xiàn)，MBD2的表達(dá)隨著結(jié)腸癌臨床分期的演進(jìn)而下調(diào)，結(jié)腸癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的MBD2的表達(dá)顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.01)；相關(guān)性分析表明，miR-222表達(dá)與MBD2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論：高表達(dá)的miR-222可通過靶向抑制MBD2的表達(dá)參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，miR-222及MBD2可成為結(jié)腸癌治療、預(yù)后判斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

微小RNA； 甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白2； 結(jié)腸癌； 臨床意義

MiRNA為長度約19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，能夠與mRNA的3’-UTR區(qū)堿基不完全或完全配對(duì)，并在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進(jìn)靶mRNA的降解和(或)抑制翻譯過程而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用，參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡。研究表明，miR-222在肝癌、胃癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤組織或細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)［1-3］。而甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白2 (methyl-CpG binding domain protein 2，MBD2)在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)［4］，在結(jié)腸癌中MBD2因啟動(dòng)子甲基化修飾而表達(dá)下調(diào)［5］。在肝門部膽管癌中miR-373可靶向抑制MBD2參與腫瘤的發(fā)生［6］。本研究采用原位雜交和免疫組化技術(shù)，分析miR-222和MBD2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)差異，探討二者與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并為尋找治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集解放軍第169醫(yī)院病理科2008年—2010年結(jié)腸癌切除標(biāo)本76例，患者術(shù)前均未接受化療及放療。按照WHO結(jié)腸癌組織學(xué)分類及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其詳細(xì)資料見表1。

1.2 試劑

地高辛標(biāo)記的miR-222原位雜交探針為Exiqon公司產(chǎn)品，MBD2單克隆抗體為Santa cruz公司產(chǎn)品，ElivisionTMplus二步法免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 原位雜交檢測miR-222在結(jié)腸癌和癌旁組織中的表達(dá)

切片脫蠟至水，原位雜交用PBS漂洗3次，每次5 min；3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，室溫消化15～20 min，原位雜交用PBS漂洗3次，每次5 min；1%多聚甲醛室溫固定10 min，DEPC水漂洗3次。預(yù)雜交液56 ℃預(yù)雜交4 h；將miR-222探針按說明添加于預(yù)雜交液中，混勻，56 ℃雜交過夜；室溫封閉30 min。然后用生物素化鼠抗地高辛室溫溫育2 h，原位雜交用PBS漂洗4次，每次5 min；DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4 免疫組化檢測結(jié)腸癌和癌旁組織MBD2的表達(dá)

采用ElivisionTMplus二步法免疫組化檢測MBD2抗體在各組中的表達(dá)情況。

1.5 原位雜交及免疫組化結(jié)果判斷

miR-222和MBD2表達(dá)的陽性染色均為棕黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，綜合染色強(qiáng)度和分布范圍進(jìn)行半定量處理，陽性強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)判斷按光鏡下觀察陽性染色的細(xì)胞比例(5個(gè)高倍視野下的均數(shù))：⑴染色細(xì)胞數(shù)少于10%為陰性；⑵染色細(xì)胞數(shù)在10%～50%為陽性；⑶染色細(xì)胞數(shù)多于50%為強(qiáng)陽性。顯微攝像并用圖像分析儀進(jìn)行光密度值檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用表示，均數(shù)兩兩比較應(yīng)用雙樣本t檢驗(yàn)，以及Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-222在結(jié)腸癌組織與癌旁組織的表達(dá)

原位雜交結(jié)果顯示，76例結(jié)腸癌組織中miR-222陽性表達(dá)70例(92.1%)，76例癌旁對(duì)照組織中miR-222陽性表達(dá)22例(28.9%)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

2.2 MBD2在結(jié)腸癌組織與癌旁組織的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，76例結(jié)腸癌組織中MBD2陽性表達(dá)15例(19.7%)，76例癌旁對(duì)照組織中MBD2陽性表達(dá)62例(81.6%)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

2.3 結(jié)腸癌組織中miR-222和MBD2的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

原位雜交及免疫組化結(jié)果經(jīng)光密度值檢測，miR-222和MBD2的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤浸潤深度、分化程度無顯著相關(guān)(P>0.05)，miR-222表達(dá)在結(jié)腸癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)，且隨著臨床分期增高而增加，臨床各期與癌旁對(duì)照組比差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MBD2表達(dá)在結(jié)腸癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)，且隨著臨床分期增高而表達(dá)下調(diào)，臨床各期與癌旁對(duì)照組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.4 miR-222和MBD2表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中miR-222和MBD2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.678，P=0.013)。隨著miR-222表達(dá)增強(qiáng)，MBD2的表達(dá)減弱。

3 討 論

表 1 結(jié)腸癌組織中miR-222和MBD2的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab. 1 Correlations of miR-222 and MBD2 expression with pathological parameters in colon carcinoma

miRNA作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子廣泛參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程。在多種腫瘤中均伴隨有miRNA表達(dá)的失調(diào)，一些miRNA家族顯示出類似癌基因或抑癌基因的功能［7］。針對(duì)miRNA在結(jié)腸癌中的研究，國內(nèi)外報(bào)道比較常見［8-11］。本課題組的前期工作運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)篩選二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)，處理人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的差異miRNA，miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)，差異的miRNA中表達(dá)下調(diào)miRNA 7個(gè)，并經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，DADS處理后以miR-222下調(diào)最為顯著，而DADS能顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長、增殖［12］。研究表明，miR-222在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)［1-3］。經(jīng)在線軟件http://www.targetscan.org/預(yù)測發(fā)現(xiàn)MBD2是miR-222的靶基因，MBD2基因位于人類染色體18q21.2上，是MBD家族(甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白家族)的一個(gè)重要成員，含有MBD和與之重疊的TRD區(qū)域，其N端含有GR重復(fù)序列，該基因能特異性結(jié)合甲基化CpG位點(diǎn)而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制作用［13］。基因的表觀遺傳修飾在個(gè)體生長發(fā)育和維持正常細(xì)胞生理活動(dòng)中起著重要的調(diào)控作用。腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)為基因組整體甲基化水平低，而抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平高；基因組整體甲基化水平降低可誘發(fā)染色體的不穩(wěn)定，而區(qū)域特異性甲基化水平升高則是抑癌基因失活的主要機(jī)制之一［14］。

對(duì)于組織和細(xì)胞miRNA的檢測方法，目前主要以qRT-PCR和原位雜交檢測。qRT-PCR檢測miRNA在組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，是對(duì)miRNA表達(dá)的定量分析，而原位雜交是對(duì)miRNA表達(dá)的定性分析，同時(shí)可根據(jù)灰度掃描進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在76例結(jié)腸癌組織中miR-222陽性表達(dá)率為92.1%，與癌旁對(duì)照組28.9%相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；miR-222的表達(dá)隨著結(jié)腸癌臨床分期演進(jìn)而增加，且結(jié)腸癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的miR-222的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)；而免疫組化結(jié)果顯示，在76例結(jié)腸癌組織中MBD2蛋白陽性表達(dá)率為19.7%，與癌旁對(duì)照組81.6%相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MBD2蛋白的表達(dá)隨著結(jié)腸癌臨床分期的演進(jìn)而下調(diào)，結(jié)腸癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的MBD2的表達(dá)顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)；相關(guān)性分析表明，miR-222表達(dá)與MBD2的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。本研究結(jié)果表明，高表達(dá)的miR-222可通過靶向抑制MBD2的表達(dá)參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。提示兩者在結(jié)腸癌的發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要作用，對(duì)結(jié)腸癌的預(yù)后判斷有其重要意義。

在轉(zhuǎn)錄后水平上，miRNA廣泛參與基因表達(dá)的調(diào)控，miRNA表達(dá)的改變可以導(dǎo)致遺傳信息表達(dá)的改變，miRNA在惡性腫瘤中具有特定的表達(dá)模式，且miRNA表達(dá)隨著臨床病理的進(jìn)展而發(fā)生改變，從而可以更準(zhǔn)確地監(jiān)測腫瘤的變化［15］。本研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miR-222可通過靶向抑制MBD2的表達(dá)參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，因此可成為結(jié)腸癌治療、預(yù)后判斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

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Expression and their clinical significance of miR-222 and MBD2 in tissues of colon carcinoma

HUANG Jian-jun, GE Li-dong, ZHOU Xiu-tian, XIE Jin-long, HU Zheng-chao, ZHOU Bo, XU Wei-hua(Department of Oncology, the 169th Hospital of PLA, Hengyang Hunan 421002, China)

ZHOU Xiu-tian E-mail：xiutianzhou@yahoo.com.cn

Background and purpose：MicroRNAs are 19 to 25-nucleotide noncoding RNA molecules that regulate gene expression at the level of transcription and translation. This study investigated the expression of the miR-222 and methyl-CpG binding domain protein 2 (MBD2) in tissues of colon carcinoma and their clinical significance.Methods：Tissue specimens and adjacent tissues of 76 cases as control from Jan. 2008 to Jun. 2010 were collected,and hybridizationin situand immunohistochemistry were used to detect the miR-222 and MBD2 expression in those specimens respectively.Results：The positive expression rate of the miR-222 was 92.1% in colon carcinoma and 28.9% in adjacent comparison. The up-regulation of miR-222 expression was associated with advanced clinical stage,and the expression of miR-222 was higher with lymph node metastasis than without lymph node metastasis in colon carcinoma. The positive expression rate of the MBD2 was 19.7% in colon carcinoma and 81.6% in adjacent comparison.The down-regulation of MBD2 expression was associated with advanced clinical stage, and the expression of MBD2 was lower with lymph node metastasis than without lymph node metastasis in colon carcinoma. The expression of miR-222 had a close negative correlation to that of MBD2 in colon carcinoma (P＜0.01).Conclusion：Overexpression of miR-222 might be associated with the tumorigenesis, development and metastasis by targeting MBD2, and they could be the indicators in the diagnosis and prognosis of colon carcinoma.

miR-222; MBD2; Colon carcinoma; Clinical significance

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.01.005

R735.3+5

A

1007-3639(2012)01-0021-04

周秀田 E-mail:xiutianzhou@yahoo.com.cn

2011-05-10

2011-12-21）