黃曲霉毒素B1誘導性大鼠肝癌超微結構觀察及DNA甲基化轉移酶3表達變化

張友才 陳金霞 張偉偉 李驥

溫州醫學院附屬第一醫院感染內科，浙江 溫州 325005

由DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)活性改變誘導的DNA甲基化模式改變是腫瘤異常表觀遺傳修飾的重要機制，主要表現為基因組整體的低甲基化和區域性高甲基化，通過改變癌基因、抑癌基因的表達和基因組的穩定性，誘導正常細胞癌性轉變［1-2］。DNMT3基因是DNMT家系重要成員，在建立組織特異性甲基化模式方面發揮關鍵作用。黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)為公認的原發性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)致癌因素之一，其致癌過程中同樣涉及DNA甲基化模式異常改變［3-6］。DNMT3在肝細胞癌變過程中動態變化的研究少見報道，本研究旨在分析AFB1誘導性大鼠肝細胞癌變不同階段DNMT3a mRNA和DNMT3b mRNA變化特征，初步研究AFB1誘導性大鼠HCC發生的表觀遺傳學機制。

1 材料和方法

1 材料

4周齡清潔級近交系雄性Wistar大鼠，體質量60～80 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。AFB1購自美國Sigma公司(批號A6636)，二甲基亞砜(DMSO)和2-乙酰氨基芴(2-AAF)購自廣州偉伯化工有限公司(編號226388、304-28-9)，2-AFF飼料為將基本飼料粉碎后，按150 g∶1 000 g充分混合而成。總RNA提取(TaKaRa RNAiso Plus)、cDNA合成及RT-PCR擴增試劑盒(TaKaRa RNA PCR Kit ver 3.0)購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

實驗分組：40只大鼠按隨機區域分組法分為正常對照組(12只)和誘癌組(28只)。按清潔級動物要求養在溫州醫學院實驗動物中心，溫度控制在(24±1)℃，相對濕度45%～70%。水和飼料任大鼠自由飲食。模型制作［7］：基本飼料喂養1周后，大鼠腹腔注射AFB1(400 μg/kg，AFB1用15 mL DMSO溶劑混勻)，每周6次，持續2周；2-AFF飼料喂養2周后，重復上述制作過程。8周后用基本飼料喂養，于37周時停藥，基本飼料喂養至53周。于實驗第25周、37周時隨機取對照組大鼠4只，誘癌組大鼠6只，斷頸處死，53周處死所有大鼠。對照組飼以基本飼料。模型制作過程中任大鼠自由飲水。

1.3 病理觀察

透射電鏡組織超微病理觀察，將所取新鮮肝組織切成1 mm3大小，用2.5%戊二醛固定，PBS漂洗后，1%鋨酸固定，制成2 μm超薄切片，用醋酸雙氧鈾、枸椽酸鉛雙重染色，使用日本日立公司H-7500型透射電鏡觀察。

1.4 RT-PCR檢測DNMT3a mRNA及DNMT 3b mRNA的表達

用RNAiso Plus試劑提取總RNA，紫外分光光度計測吸光度(D)值，以D260/D280=1.8～2.0為RNA質量判斷標準。按試劑盒說明書要求合成cDNA。DNMT3a上游引物：5’-GGCCTTATGGGCTGAGAAGA-3’，下游引物：5’-CTCATACTCGGGCTCGTCAT-3’；DNMT3b上游引物：5’-TGAAGGGAGACAGCAGACAT-3’，下游引物：5’-GCGGCCTCTGGTCTCTGGTG-3’；GAPDH上游引物5’-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3’，下游引物5’-CACCAGTGGATGCAGGGAT-3’；產物長度分別為226、176和477 bp。反應條件：94 ℃預變性5 min后，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s(擴增DNMT3b時為54 ℃)，72 ℃延伸45 s，循環30次后，72 ℃終延伸5 min。取PCR反應產物5 μL，用2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在凝膠成像系統(Biosens Sc 810)分析結果。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠肝組織病理及超微病理改變

誘癌組大鼠25周時肝細胞以變性、壞死損傷病變為主。電鏡下肝小葉結構基本完整，肝竇擴張，肝細胞脂肪變性腫脹，小葉內可見灶性壞死伴炎性細胞浸潤，細胞核稍增大，細胞質淡染，未見腫瘤發生。37周時5只大鼠肝表面可見微小顆粒。電鏡下：肝小葉結構破壞, 可見灶狀增生性空泡變性或透明變性小肝細胞，核圓形，深染或多核，可見病理性核分裂相。異形肝細胞構成增生結節，匯管區內可見卵圓細胞、結締組織增生。另1只大鼠肝組織未見腫瘤細胞(以損傷病變為主)。47周死亡大鼠2只，49周時有3只大鼠死亡，死亡率為17.86%。53周時，10只大鼠肝表面可見大小不一結節。光鏡下：細胞形態大小不一致，細胞核深染，體積增大，可見巨核、多核及多形核，核質比增大，癌細胞排列為粱狀、腺狀、實片狀，肝細胞增生灶和結節較多。2只大鼠肝癌組織中觀察到肝細胞吞噬細胞現象，1只大鼠無腫瘤發生(為損傷病變)。

對照組25周時透射電鏡下大鼠肝細胞形態規整，核質比正常，細胞核位于中央，呈圓形或卵圓形，染色質淺淡，細胞器分布均勻。誘癌組大鼠多數肝細胞形態尚規則，呈圓形，肝細胞核仁稍增大，核質比基本正常，核內異染色質較豐富，呈細顆粒狀彌漫分布。少數肝細胞異染色質色深，呈核膜邊集，線粒體輕度腫脹、增生，粗、滑面內質網增生、擴張，糖原顆粒多見。37周時電鏡下肝細胞腫脹明顯，核體積增大，核膜固縮，異染色質在核膜下聚集，核仁深染。細胞質內線粒體數目增多，腫脹，嵴變短，減少，基質密度增加，呈粗顆粒狀。粗面內質網增生，呈囊性擴張或裂成泡狀。部分肝細胞線管狀滑面內質網增生。糖原顆粒可見。53周時電鏡下瘤細胞大小不一致。細胞核深染、大小不均。核膜曲折內陷或外凸，異染色質豐富，呈粗顆粒狀彌漫分布或凝集成塊堆集在核膜下。可見巨核、雙核，甚至多核。細胞核形態不規整，可見怪異核。核仁體積增大，數目增多，形態不規則，靠邊。線粒體明顯增生、腫脹，濃淡不一，多數肝細胞數目減少，基質變淡透亮，甚至基質顆粒消失，呈空泡狀。部分肝細胞可見線管狀滑面內質網增生。糖原顆粒偶見。肝細胞間纖維結締組織增生明顯。可見淋巴細胞浸入肝細胞內，細胞質內可見吞噬細胞溶解物堆集。可見肝細胞吞噬細胞現象，細胞內大塊致密物沉積，細胞核固縮、濃集(圖1)。

2.2 肝組織中DNMT3a mRNA、3b mRNA表達水平

圖1 正常肝組織和不同時期肝損傷透射電鏡圖Fig.1 Normal liver tissue and injured liver tissues in different stage by transmission electron microscope

經RT-PCR擴增，DNMT3a mRNA、3b mRNA在兩組大鼠肝組織中均有表達，其相對分子質量分別為226 bp和176 bp(圖2、3)。DNMT3a mRNA、3b mRNA在癌腫組織中表達水平均顯著高于其他各組大鼠肝組織(F=23.95，P=0.000；后者F=15.07，P=0.000)。對照組大鼠肝組織中DNMT3a mRNA表達水平明顯低于損傷病變、早期癌變肝組織(t=10.37，P=0.000；后者t=6.60，P=0.000)，而大鼠損傷病變、早期癌變肝組織間其表達水平的差異無統計學意義(t=0.59，P=0.58)。DNMT3b mRNA在早期癌變肝組織中的表達水平均明顯高于大鼠損傷病變、對照組大鼠肝組織(t=3.51，P=0.006；后者t=3.18，P=0.013)，而在對照組大鼠肝組織與大鼠損傷病變肝組織間其表達水平的差異均無統計學意義(t=1.35，P=0.22，表1)。

圖2 DNMT3a mRNA表達產物的2%瓊脂糖電泳圖譜Fig.2 DNMT3a mRNA expression products by 2%agarose gel electrophoresis

圖3 DNMT3b mRNA表達產物的2%瓊脂糖電泳圖譜Fig.3 DNMT3b mRNA expression products by 2%agarose gel electrophoresis

表1 大鼠肝組織中DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA表達水平Tab.1 DNMT3a mRNA and DNMT3b mRNA expression levels in rat liver tissues

3 討 論

目前誘導性大鼠肝癌模型的制作主要應用二乙基亞硝胺和AFB1，制作過程中常加入四氯化碳、2-乙酰氨基芴、二甲基亞砜等促癌劑或切除部分肝葉促癌。因AFB1為人類HCC明確的病因之一，其誘導大鼠HCC模型的制作、癌變機制的研究倍受重視。本組大鼠模型中，25周大鼠肝組織病變以肝細胞變性損傷為主，37周時多數大鼠肝組織可見肝細胞異型性明顯，表現為癌前病變為主，53周時大鼠肝細胞則可見典型肝癌。觀察到肝細胞呈變性損傷，異型性到癌變；線粒體由增生腫脹到枯竭、空泡變；糖原顆粒呈漸減少等特征性變化。還觀察到典型肝細胞吞噬細胞現象。不足之處：與用二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌模型相比，AFB1誘導模型的制作周期明顯延長，制作費用高，大鼠病死率較高(17.86%)。

一般認為，AFB1誘導肝癌機制與引起基因組遺傳性改變有關，與誘導DNA甲基化模式異常改變的機制未引起重視。研究表明，DNMT活性增加能促進DNA堿基中甲基化的胞嘧啶脫氨基，胞嘧啶加速變為胸腺嘧啶，導致DNA易于發生點突變；促進腫瘤抑制基因發生高甲基化，引起其表達沉寂，參與正常細胞癌性轉變的發生和發展［8-9］。Park等［10］報道，DNMT3a和DNMT3b在人HCC癌腫組織中表達的陽性率(59.3%和55.6%)均顯著高于癌旁非腫瘤組織中的陽性率(22.2%和0%，P均<0.05)，認為DNMT3a、DNMT3b與人HCC發生有關。OH等［11］報道，DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA在人HCC癌腫組織中表達水平最高，均明顯高于慢性肝炎、肝硬化組織(癌旁肝組織)和正常組織，DNMT3b mRNA在正常肝組織與HCC癌旁慢性肝炎、肝硬化組織的表達水平間差異無統計學意義，也認為DNMT3a、DNMT3b基因參與人肝細胞的癌變機制。

目前有關AFB1誘導大鼠肝細胞癌變演進過程中DNMT3基因表達水平變化的研究少見報道。本研究中，DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA在大鼠肝癌組織中的表達水平明顯高于正常肝組織、損傷肝組織和早期癌變肝組織。結果與上述報道結論相類似。與OH等 結果不同，DNMT3b mRNA在對照組37周肝組織中的表達水平均明顯高于大鼠損傷病變肝組織、對照組正常大鼠肝組織，不能除外可能因致癌因素不同引起的結果差異。另外，Oh等［11］報道5例HCC癌腫組織和癌旁非癌腫組織中，DNMT3a mRNA表達水平相近，4例DNMT3b mRNA表達水平相近。本研究也有類似發現，提示可能除DNMT3 mRNA表達變化以外，尚有其他致肝細胞癌變機制。

細胞自噬現象是一種腫瘤抑制機制，與癌前病變、癌細胞增殖及其抑制存在密切關系［12-13］。本研究2只大鼠肝癌組織中觀察到典型的肝細胞吞噬細胞現象，其癌組織中DNMT3a mRNA表達水平近似于其他肝組織，1只大鼠癌組織中DNMT3b mRNA表達較高。肝細胞吞噬細胞現象發生機制不明，有待進一步研究。

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