Importin 13在子宮內膜異位癥和子宮內膜癌中的表達及意義

龍行濤 王冬 田桂蘭 胡建國

1.重慶市腫瘤研究所，重慶市腫瘤醫院婦瘤科，重慶 400030；2.重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科，重慶 400010

Importin 13在子宮內膜異位癥和子宮內膜癌中的表達及意義

龍行濤1王冬1田桂蘭1胡建國2

1.重慶市腫瘤研究所，重慶市腫瘤醫院婦瘤科，重慶 400030；2.重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科，重慶 400010

背景與目的：正常情況下的子宮內膜干/祖細胞有助于子宮內膜的生理性修復，而子宮內膜干/祖細胞的異常增殖和異常分化則會導致子宮內膜疾病(如子宮內膜異位癥和子宮內膜癌)。Importin 13(IPO13)是importin β家族新成員的一個核質雙向的轉運受體蛋白，是角膜上皮干細胞的一個標記，在維持干細胞的性狀、高增殖潛力、低分化狀態，調節細胞分化以及小鼠生殖細胞減數分裂上具有重要的作用。本文探討成體干細胞標記IPO13在子宮內膜異位癥和子宮內膜癌中的表達及意義。方法：手術取正常子宮內膜組織40例(對照組)，其中增生期和分泌期各20例，異位子宮內膜組織20例(異位癥組)和子宮內膜癌病灶組織20例(內膜癌組)。采用免疫組化SP法檢測IPO13蛋白在細胞內的定位；采用實時熒光定量PCR技術(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測IPO13 mRNA的表達；Western blot檢測IPO13蛋白的表達。結果：IPO13蛋白在內膜癌、異位癥及正常對照組中腺上皮細胞和間質細胞的細胞質和細胞核中均有表達。IPO13蛋白在對照組增生期表達量(0.52±0.30)明顯高于分泌期(0.25±0.04，P＜0.05)；IPO13蛋白在異位癥組表達量(0.81±0.12)明顯高于對照組增生期及分泌期(P＜0.05)；IPO13蛋白在內膜癌組表達量(1.21±0.11)明顯高于異位癥組(P＜0.05)。IPO13 mRNA在對照組增生期表達量是分泌期的3倍(P＜0.05)；IPO13 mRNA在異位癥組中表達量是對照組分泌期的6倍(P＜0.05)，增生期的2.5倍(P＜0.05)；IPO13 mRNA在內膜癌組表達量是異位癥組的2倍(P＜0.05)。結論：IPO13在子宮內膜癌中及異位癥組中表達明顯高于對照組，推測其高表達與子宮內膜癌及子宮內膜異位癥發病密切相關。

子宮內膜異位癥； 子宮內膜癌； Importin 13； 子宮內膜干細胞

近年來研究認為，正常情況下的子宮內膜干/祖細胞有助于子宮內膜的生理性修復，而子宮內膜干/祖細胞的異常增殖和異常分化則會導致子宮內膜疾病(如子宮內膜異位癥和子宮內膜癌)［1-2］。Importin 13(IPO13)是importin β家族新成員的一個核質雙向的轉運受體蛋白，是角膜上皮干細胞的一個標記，在維持干細胞的性狀、高增殖潛力、低分化狀態，調節細胞分化以及小鼠生殖細胞減數分裂上具有重要的作用［3-5］。本研究擬采用免疫組化、熒光定量PCR技術(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)以及免疫印跡的方法檢測IPO13在子宮內膜異位癥和子宮內膜癌患者內膜中的表達，探討其與子宮內膜異位癥和子宮內膜癌發生、發展的關系及意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

隨機選取重慶市腫瘤醫院2010年7月—2011年4月開腹或者腹腔鏡手術治療的卵巢子宮內膜異位囊腫、子宮內膜癌和其他非激素依耐性良性內膜疾病做宮腔鏡檢查的患者。征得重慶市腫瘤醫院倫理委員會通過并與患者達成協議，于手術時取異位子宮內膜組織20例(異位癥組)和子宮內膜癌病灶組織20例(內膜癌組)。正常子宮內膜采用美國史賽克公司5.07 mm連續灌流宮腔檢查及治療鏡，取正常子宮內膜40例(增生期和分泌期各20例，對照組)，子宮內膜組織各約0.5～1.0 g。以上各組患者在年齡等因素中具有可比性(P>0.05)。所有患者月經周期均規律，術前3個月未接受激素治療，未妊娠及哺乳。經組織病理學檢查證實，排除了合并子宮腺肌病、功血、多囊卵巢綜合征等其他激素依賴性疾病患者。

1.2 實驗方法

1.2.1 IPO13細胞內定位

4%甲醛固定組織標本，常規石蠟包埋，組織切片厚4 μm，HE染色后鏡下觀察到典型子宮內膜組織者為入選標本。山羊抗人IPO13(NB100-1369，稀釋度1∶100)多克隆抗體(Novus Biologicals)，免疫組化步驟按免疫組化SP試劑盒說明書操作，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。陽性結果判定標準：光鏡下每張切片選取5個有代表性高倍鏡視野，計數1 000個細胞，計算陽性細胞百分率。陰性為染色細胞數<5%，陽性為染色細胞數>5%。其中弱陽性為染色細胞數≤25%；強陽性為陽性染色細胞數>50%)［6］。

1.2.2 熒光定量RT-PCR檢測IPO13 mRNA的表達

用TRIzol(GIBCO公司)抽提組織總RNA，逆轉錄，PCR擴增IPO13，并擴增β-actin作為內參物，逆轉錄試劑盒和RNA提取試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。β-actin和IPO13引物以及熒光定量PCR試劑盒購于廣州復能基因有限公司(貨號分別為：Hs-QRP-20056、Hs-QRP-20468)。反應條件：預變性 95 ℃10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，重復40個循環。陰性對照以無RNA酶的水代替cDNA模板，每例樣品及對照均設3個平行復孔，取平均值。反應結束后，由軟件自動得出熒光反應曲線以及每個標本反應體系的擴增效率及CT值，實驗不同時間重復6次。

1.2.3 IPO13蛋白檢測

裂解組織以每孔25 μg上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜，依次加入山羊抗人IPO13多克隆抗體(稀釋度1∶500)和辣根過氧化酶物標記驢抗羊IgG，化學熒光發光法(ECL)顯影(碧云天公司)。操作過程按說明書進行。用凝膠成像系統成像，對結果進行灰度掃描分析，相對表達量以IPO13灰度面積積分分別與內參的比值計算。

1.3 統計學處理

統計分析運用SPSS 11.5軟件，實驗數據為正態分布，所有數據方差具有齊同性，采用獨立樣本t檢驗進行比較分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組化結果

IPO13蛋白在內膜癌、異位癥及正常對照組中子宮內膜腺上皮細胞和間質細胞的細胞質和細胞核中均有表達，主要表達于上皮細胞中(圖1)。

2.2 IPO13 mRNA在各組內膜中表達

IPO13 mRNA在對照組增生期表達量是分泌期的3倍(P<0.05)；在異位癥組中表達量是對照組分泌期的6倍(P<0.05)，增生期的2.5倍(P<0.05)；在內膜癌組表達量是對照組增生期的4倍(P<0.05)，分泌期的約10倍(P<0.05)，異位癥組的2倍(P<0.05，圖2)。

2.3 IPO13蛋白定量的檢測

IPO13蛋白在對照組增生期、分泌期、異位癥和內膜癌組中的表達率均為100%，表達量分別為0.52±0.30、0.25±0.04、0.81±0.12和1.21±0.11。對照組增生期IPO13蛋白的表達量顯著高于分泌期(P<0.05)；異位癥組IPO13蛋白表達量均高于對照組分泌期及增生期(P<0.05)；內膜癌組IPO13蛋白表達量均高于對照組分泌期及增生期也顯著高于異位癥組(P均<0.05，圖3)。

3 討 論

IPO13是目前所知的哺乳動物細胞中唯一具有雙向轉運功能的受體蛋白［4］。另外研究還發現，IPO13的表達受到糖皮質激素和機體發育期的雙重調控，IPO13能夠轉運pax-6、pax-3、ubc9、MGN、RBM8、ElF1A、糖皮質激素受體和肌足蛋白，并且IPO13和這些蛋白相互作用，精確地調控胚胎腦、肺和心臟的發育［3，5，7-10］。在角膜上皮干細胞中，IPO13對保持角膜緣干細胞的性狀、高增殖潛力、低分化狀態具有重要的作用。本研究顯示，在子宮內膜癌及異位內膜組織中IPO13 mRNA轉錄以及蛋白翻譯水平存在明顯上調。

子宮內膜異位癥是一種良性疾病，但卻具有浸潤、廣泛種植和易復發等與惡性腫瘤相似的一些生物學特征［11］。因此，傳統的觀點認為子宮內膜異位癥是一種類癌疾病。近年來研究認為，子宮內膜疾病是子宮內膜干/祖細胞增殖分化異常引起的［1，12］，異位內膜組織中干細胞相關基因TCL1、UTF1和SALL4比正常內膜表達增加［12］，調控干細胞增值分化的c-kit在異位內膜中表達也上調［13］。子宮內膜異位癥病灶雖為多中心起源，但每一局部病灶細胞呈明顯克隆性，而具有克隆能力是干細胞特征之一，提示子宮內膜異位癥病灶可能是干細胞。IPO13在維持成體干細胞的“干性”、調控干細胞克隆形成和增殖分化中具有重要作用［4］。本研究發現，異位癥組IPO13表達較對照組增生期及分泌期內膜顯著上調，這可能是異位內膜中子宮內膜干/祖細胞增殖分化異常引起的。因此，本研究推測IPO13/干細胞因子軸在子宮內膜異位癥的發病中具有重要的意義，高表達IPO13蛋白可能與子宮內膜異位癥的浸潤、復發相關。

Gargett等［14］通過對子宮內膜上皮和基質細胞克隆形成能力的鑒定證實子宮內膜干細胞的存在。在子宮內膜癌中，維持成體干細胞“干性”的Wnt/β-catenin和PTEN信號通路表達異常，端粒酶表達和活性增加也說明子宮內膜癌是一種干細胞疾?。?2，15］。腫瘤細胞和干細胞一樣，具有自我更新和高增殖活性［16-17］。本研究發現，在子宮內膜癌中IPO13從轉錄水平到蛋白表達水平顯著上調，其表達顯著高于對照組及內膜異位癥組。因此，IPO13可能與子宮內膜癌的發病、惡性進展密切相關。在子宮內膜癌中，可能受IPO13異常調節作用而發生了核質轉運異常，但具體調節機制目前仍然不清楚，需進一步研究。但本研究為從調控子宮內膜干/祖細胞的增殖和分化的視角研究內膜癌發病機制奠定了相關理論基礎。

綜上所述，子宮內膜異位癥和子宮內膜癌的發生是多基因多步驟綜合作用的結果。IPO13是調控干細胞增殖分化中的蛋白，在調節細胞增殖分化中具有重要的作用。IPO13可能參與了內膜異位癥和內膜癌中子宮內膜干/祖細胞的異常增殖和分化的調控，其異常高表達有促進子宮內膜/干祖細胞異常增殖和異常分化的作用。目前臨床上對于子宮內膜異位癥的治療還停留在手術和調控體內激素分泌上。因此，從調控子宮內膜干/祖細胞的增殖和分化的視角去研究子宮內膜異位癥和子宮內膜癌的發病機制和治療，還有待于進一步深入。

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The expression and significance of importin 13 in endometriosis and endometrial carcinoma

LONG Xing-tao, WANG Dong, TIAN Gui-Lan, HU Jian-guo(Department of Gynecologic Oncology,Chongqing Cancer Hospital, Chongqing Tumor Institute, Chongqing 400030, China)

WANG Dong E-mail：cqwindow120@163.com

Background and purpose：Human uterine stem/progenitor cells activity contributes to the physiological endometrial repair, but abnormal proliferation and abnormal differentiation of uterine stem/progenitor cells will lead to endometrial disease (such as endometriosis and endometrial carcinoma). Importin 13 (IPO13) is the new family member of importin β, a two-way transfer of nuclear receptor proteins and a marker of corneal epithelial stem cells. In the maintenance of stem cells, high proliferative potential and poorly differentiated state play important roles in regulating normal and abnormal of cell differentiation and mouse germ cells meiosis. The study investigated the expression ofIPO13gene, an adult stem cell marker, in endometriosis and endometrial carcinoma tissues for the purpose of finding the relationship between this gene and endometriosis and endometrial carcinoma.Methods：The expression of IPO13 in normal endometrial tissues, endometriosis tissues and endometrial carcinoma tissues was detected by the immunohistochemistry, real-time PCR and Western blot respectively.Results：In endometrial carcinoma, endometriosis and control groups, the expression of IPO13 protein was found in cytoplasm and nucleus of epithelial cells and stromal cells. The expression level of IPO13 protein in normal proliferative phase endometrium was 0.52±0.30, significantly higher than that in normal secretory phase (0.25±0.04,P＜0.05); IPO13 protein in the ectopic endometrium was 0.81±0.12, significantly higher than that in proliferative phase and secretory phase endometria(P＜0.05); IPO13 protein in the endometrial carcinoma was 1.21±0.11, significantly higher than that in the ectopic endometrium (P＜0.05). The expression level of IPO13 mRNA in normal proliferative phase endometrium was 3 times higher than that in normal secretory phase (P＜0.05); IPO13 mRNA in the ectopic endometrium was 2.5 times higher than that in normal proliferative phase endometrium and 6 times higher than that in normal secretory phase endometrium(P＜0.05); IPO13 mRNA in the endometrial carcinoma were 2 times higher than that in the ectopic endometrium (P＜0.05).Conclusion：The expression of IPO13 in endometrial carcinoma and endometriosis is increased, which suggests IPO13 is closely related with endometrial cancer and endometriosis.

Endometriosis; Endometrial carcinoma; Importin 13; Endometrial stem cells

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.01.003

R737.33

A

1007-3639(2012)01-0010-05

重慶市衛生局課題資助(NO：08-2-284)。

王冬 E-mail:cqwindow120@163.com

2011-07-20

2011-11-07）