浙貝母堿對肺癌A549/DDP細胞多藥耐藥的逆轉作用觀察及機制探討

唐曉勇，唐迎雪

(1山東中醫藥大學，濟南250355;2山東省腫瘤醫院)

目前，干預和克服多藥耐藥是提高肺癌療效的重要手段。浙貝母堿是中藥浙貝母的主要成分，近年來其抗腫瘤作用逐漸得到廣泛認同。人肺耐藥蛋白(LRP)被認為與順鉑(DDP)原發耐藥關系密切。2010年3月～2011年6月，我們觀察了浙貝母堿對人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP多藥耐藥的逆轉作用，并進一步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP購自上海拜力生物科技有限公司。浙貝母堿(貝母素甲)，順鉑，RPMI-1640培養基和12%小牛血清，MTT，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，鼠抗人LRP單克隆抗體。EL340i酶標儀，FACS Calibur流式細胞儀，LSM510型激光共聚焦顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549/DDP細胞用12%胎牛血清培養，用2μg/mL的DDP維持其耐藥性;在37℃、5%CO2的培養箱中培養，2 d傳代1次。實驗前2周將A549/DDP細胞換用無DDP的培養基培養，選取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 浙貝母堿對A549/DDP細胞增殖的影響及其逆轉耐藥最佳濃度的確定 采用MTT法。將處于對數生長期的A549/DDP，用胰蛋白酶、EDTA消化后計數;用含12%胎牛血清在RPMI-1640培養基配成一定濃度，以5×103/孔接種96孔板;細胞貼壁后，實驗組加入終質量濃度分別為50、100、200、400、800μg/mL的浙貝母堿，置37 ℃、5%CO2的培養箱中培養;對照組加相同濃度的藥物溶解介質，每個濃度設3個平行孔。培養48 h后，每孔分別加入20μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續培養4 h。然后以1 000 r/min離心3 min，棄上清;每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。全自動酶標儀于570 nm處測定各孔吸光值(A值)，參比波長為630 nm。實驗重復3次，取平均值。細胞增殖抑制率=(1－實驗組A值/對照組A值)×100%。根據文獻，確定細胞增殖抑制率≤5%的藥物濃度為該藥的非細胞毒性濃度，并作為最佳逆轉耐藥濃度。

1.2.3 浙貝母堿對A549/DDP細胞耐藥逆轉作用的觀察 采用 MTT法。將處于對數生長期的A549/DDP，消化、接種同 1.2.2。對照組分別加入終質量濃度為 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL的DDP，實驗組在對照組基礎上再加入逆轉濃度的浙貝母堿。全自動酶標儀于570 nm處測定各孔A值，參比波長為630 nm。實驗重復3次，取平均值。細胞增殖抑制率=(1－實驗組A值/對照組A值)×100%。采用直線回歸方程計算出細胞生長抑制率50%時的DDP濃度，即為半數抑制濃度(IC50)。逆轉倍數=對照組IC50/實驗組IC50。

1.2.4 浙貝母堿對A549/DDP細胞凋亡影響的觀察 采用流式細胞術。取處于對數生長期的A549/DDP，分為3組。空白對照組不加任何藥物，對照組加入DDP(終質量濃度為4μg/mL)，實驗組在對照組基礎上再加入逆轉濃度的浙貝母堿。藥物作用48 h后，吹打成細胞懸液;以2 000 r/min離心5 min，收集細胞;用PBS洗滌細胞2次，收集2×105個細胞，加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞;加入5μL Annexin V-FITC混勻后，再加入20μL Propidium Iodide混勻;室溫避光，反應5～15 min;加入250μL Binding Buffer到樣品中，混勻后300目尼龍網過濾;在1 h內進行流式細胞儀的上機觀察和檢測分析，激發波長(Ex)為488 nm，發射波長(Em)為530 nm。

1.2.5 浙貝母堿對A549/DDP細胞中LRP蛋白表達影響的觀察 采用細胞免疫熒光法。取對數生長期的細胞，分組及處理同1.2.4。培養48 h后取出蓋玻片，以PBS液漂洗3次;按試劑盒說明操作，熒光顯微鏡下觀察。LRP蛋白陽性表達細胞呈現綠色熒光。高倍鏡下(×200)隨機觀察5個視野，計算陽性細胞個數，取平均值，表示LRP蛋白表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。組間數據比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 浙貝母堿對A549/DDP細胞增殖的影響及其逆轉耐藥的最佳濃度 50、100、200、400、800 μg/mL的浙貝母堿作用48 h，A549/DDP細胞增殖抑制率分別為 2.31% ± 0.25%、2.58% ± 0.17%、3.62% ±1.12%、4.54% ±0.86%、9.33% ±0.22%，浙貝母堿逆轉耐藥的最佳濃度為400μg/mL。

2.2 浙貝母堿對A549/DDP細胞耐藥的逆轉作用各組隨DDP濃度的增加，浙貝母堿對A549/DDP細胞增殖抑制率不斷增加(P均＜0.05)。實驗組DDP 的 IC50為4.15 μg/mL，對照組為15.46 μg/mL，浙貝母堿的逆轉耐藥倍數為3.73。見表1。

表1 浙貝母堿對A549/DDP細胞耐藥的逆轉作用

2.3 浙貝母堿對A549/DDP細胞凋亡的影響 培養48 h后，空白對照組的細胞凋亡率為2.56% ±0.44%，對照組為 13.5% ± 1.42%，實驗組為38.16% ±2.25%;實驗組細胞凋亡率與對照組、空白對照組比較，P均＜0.05。

2.4 浙貝母堿對A549/DDP細胞LRP蛋白表達的影響 培養48 h后，空白對照組LRP蛋白陽性表達細胞為(9.8 ±1.92)個/HP，對照組為(9.2 ±1.9)個/HP，實驗組為(5.8 ±1.3)個/HP;實驗組 LRP 蛋白陽性表達細胞數與對照組、空白對照組比較，P均＜0.05。

3 討論

腫瘤多藥耐藥的可能機制包括細胞內的藥物濃度降低、藥物解毒系統活性增強［1］、DNA修復機制增強［2，3］、藥物誘導凋亡的變更［4，5］等。其中 LRP 介導的藥物外排機制是DDP耐藥的重要原因。LRP與P-gp、MRP不同，不屬于ABC超家族成員，也沒有與ATP結合的跨膜轉運區域。LRP主要分布于細胞質而非細胞膜，是構成人體穹窿蛋白的主要成分，廣泛分布在人體與外界相通的體腔上皮、血腦屏障、巨噬細胞和分泌性器官中，被認為與機體清除有害物質有關。研究［6］證實，LRP與鉑類藥物的原發性耐藥關系密切。LRP誘導肺癌細胞多藥DDP耐藥的機理包括:①阻止DDP進入細胞核，或者將己進入核內的藥物通過轉運載體泵至核外;②將胞質中的DDP轉運至囊泡，使藥物呈房室性分布，通過胞吐機制將藥物排至細胞外。

耐藥逆轉劑的研究，現代醫學主要從應用分子生物學技術(如小干擾RNA沉默耐藥相關基因［7］)和化學合成藥物(如托瑞米芬［8］、環孢菌素［9］、維拉帕米［10］等)方面展開，多因技術繁瑣或不良反應大而未廣泛應用于臨床。浙貝母是臨床上常用化痰藥物，其藥理作用包括鎮咳化痰、松弛支氣管平滑肌［11］，鎮痛、抗炎［12］，降壓、活血化瘀，抗潰瘍及逆轉細菌耐藥［13］等作用。作為浙貝母的主要成分，浙貝母堿的抗腫瘤作用越來越得到廣泛認同，尤其是在逆轉腫瘤耐藥方面具有廣泛的研究前景，有望成為有效的多藥耐藥逆轉劑。胡凱文等［14］應用浙貝母堿逆轉白血病細胞的多藥耐藥現象，MTT顯示浙貝母堿對阿霉素殺傷多藥耐藥K562/A02、HL-60/Adr細胞株具有明顯的增敏作用，逆轉倍數約為5。流式細胞儀顯示，浙貝母堿通過抑制耐藥細胞P-gp蛋白表達，從而增加了DNR在耐藥白血病細胞內的蓄積，逆轉了部分細胞的耐藥性。本研究結果顯示，浙貝母堿逆轉耐藥倍數3.73。與空白對照組、對照組比較，實驗組細胞凋亡率增高，表達量明顯降低(P＜0.05)。因此，浙貝母堿可逆轉肺癌A549/DDP細胞株的多藥耐藥，其機理與促進細胞凋亡、下調L-RP蛋白表達介導藥物重新分布有關。

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