熱療聯(lián)合順鉑對(duì)小細(xì)胞肺癌NCI－H446細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制探討

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000)

小細(xì)胞肺癌(SCLC)惡性程度極高，早期易發(fā)生淋巴及血行轉(zhuǎn)移，臨床確診時(shí)常已有廣泛轉(zhuǎn)移，并且治療后容易復(fù)發(fā)［1］。熱療作為一門新興技術(shù)，在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮了重要作用。研究［2～4］表明，熱療與化療聯(lián)合應(yīng)用，可以提高某些惡性腫瘤的治療效果。2010年9月～2011年5月，我們觀察了單獨(dú)應(yīng)用熱療、順鉑以及二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SCLC細(xì)胞凋亡的影響，并通過(guò)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl－2的表達(dá)變化，探討其對(duì)SCLC細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制，為SCLC的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SCLC細(xì)胞株NCI－H446由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)引進(jìn)，順鉑注射液購(gòu)于豪森藥業(yè)股份有限公司，新生小牛血清和RPMI－1640培養(yǎng)基分別購(gòu)于杭州四季青公司和美國(guó)Gibco公司;聚丙烯酰胺凝膠購(gòu)于TaKaRa公司，Bax和Bcl－2一抗購(gòu)于武漢博士德公司，AV－PI試劑盒購(gòu)于上海晶美生物公司，Werstern blot試劑盒、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)、電泳槽(美國(guó)BD公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Gene公司)由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將 NCI－H446細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基37℃、CO2孵育箱中培養(yǎng)，2～3 d換新鮮培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用0.25%胰酶消化分散，進(jìn)行傳代培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 NCI－H446細(xì)胞凋亡情況的觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 NCI－H446細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL。將細(xì)胞隨機(jī)分為 A、B、C、D組。取6孔板，每組3個(gè)平行孔，每孔接種細(xì)胞懸液2 mL。A組常規(guī)培養(yǎng)，不進(jìn)行特殊處理;B組將細(xì)胞消化后放置離心管中，在42℃水浴中加熱2 h;C組依據(jù)參考文獻(xiàn)［5］，加入含2μg/mL順鉑的培養(yǎng)液每孔4 μg;D組先經(jīng)過(guò)水浴處理后加入順鉑，具體方法同上。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，吸去上清液，常規(guī)消化細(xì)胞;以1 500次/min離心5 min，棄上清;PBS重懸細(xì)胞后，移至EP管中，再次以1 500次/min離心5 min。加5μL的 AnnexinⅤ－FITC溶液和2.5μL的 PI到100μL的細(xì)胞混懸液中，混合后室溫避光反應(yīng)30 min，加入反應(yīng)緩沖液400μL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 NCI－H446 細(xì)胞中 Bax 和 Bcl－2 的檢測(cè) 采用Western blot法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 NCI－H446細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL。分組及處理方法同1.2.2，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收取細(xì)胞，加入預(yù)冷裂解緩沖液，超聲勻漿，低溫超速離心(4℃，12 000 r/min離心30 min)。吸取上清液為總蛋白，Lowry法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度至50μg/20μL。10%SDS－PAGE凝膠90 V電泳3 h后轉(zhuǎn)印。緩沖液洗膜后1%BSA封閉非特異性抗原2 h。緩沖液洗膜后，與一抗(1∶250)4℃孵育過(guò)夜。緩沖液洗膜后與堿性磷酸酶標(biāo)記二抗(1∶200)室溫下孵育2 h。NBT/BCIP顯色15 min，以NC膜上出現(xiàn)清晰的棕褐色條帶為陽(yáng)性，終止顯色，漂洗并干燥后避光保存。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)顯色條帶掃描的灰度值進(jìn)行定量分析，以Bax和Bcl－2與內(nèi)參β－actin的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間細(xì)胞凋亡率比較行χ2檢驗(yàn)，組間Bcl－2、Bax表達(dá)比較行方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組 NCI－H446細(xì)胞凋亡率比較 NCI－H446細(xì)胞凋亡率 A 組4.25% ±0.56%、B組8.12% ±0.64%、C 組 10.02% ± 0.82%、D 組 12.12% ±0.49%;B、C、D 組 NCI－H446 細(xì)胞凋亡率與 A 組比較，P 均 ＜0.05;D 組與 B、C 組比較，P 均 ＜0.05;B、C 組比較，P ＞0.05。

2.2 各組 NCI－H446 細(xì)胞中 Bcl－2、Bax 相對(duì)表達(dá)量比較 見表1。

表1 各組NCI-H446細(xì)胞中Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表1 各組NCI-H446細(xì)胞中Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與A 組比較，*P ＜0.05;與 B、C 組比較，△P ＜0.05

Bcl－2 Bax A組組別0.89 ±0.002 8 0.18 ±0.001 8 B 組 0.61 ±0.004 2* 0.32 ±0.002 0*C 組 0.30 ±0.003 6* 0.48 ±0.001 4*D 組 0.21 ±0.001 7＊△ 0.64 ±0.002 5＊△

3 討論

熱療作為一種無(wú)創(chuàng)、不良反應(yīng)少、療效良好的治療方法，為晚期惡性腫瘤的治療提供了一種新的手段。目前，研究認(rèn)為熱療抗腫瘤的機(jī)制包括直接殺傷腫瘤細(xì)胞，以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Krause等［6］發(fā)現(xiàn)，Ewing's肉瘤細(xì)胞在42℃環(huán)境中持續(xù)2 h后可產(chǎn)生細(xì)胞凋亡，并檢測(cè)到凋亡相關(guān)基因Caspase－3顯著激活。Li等［7］研究顯示，對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞進(jìn)行加熱治療15、30、45 min后，通過(guò)流式細(xì)胞儀均可檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，并有一定程度的微血管損害。另外，熱療還可增強(qiáng)某些化療藥物的細(xì)胞毒作用。Ostrow等［8］對(duì)環(huán)磷酰胺在41.8℃和37℃時(shí)的藥代動(dòng)力學(xué)及藥物與熱療間的協(xié)同性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)高熱能促進(jìn)未代謝的環(huán)磷酰胺在線粒體中代謝。順鉑為鉑的金屬絡(luò)合物，作用類似于雙功能烷化劑。其主要作用靶點(diǎn)為DNA，作用于DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈，形成DDP－DNA復(fù)合物，干擾DNA復(fù)制。順鉑屬細(xì)胞周期非特異性藥物，具有抗瘤譜廣、抗瘤作用強(qiáng)、與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用且無(wú)交叉耐藥等特點(diǎn)，為當(dāng)前治療SCLC聯(lián)合化療中最常用的藥物之一。

細(xì)胞凋亡及基因調(diào)控異常，使得細(xì)胞的生態(tài)平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［9］。其中，腫瘤細(xì)胞凋亡抑制是其發(fā)生的原因之一。研究［10］顯示，細(xì)胞凋亡指數(shù)可作為預(yù)測(cè)SCLC患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)，凋亡指數(shù)越低，患者的生存期縮短，預(yù)后差。本研究結(jié)果顯示，B、C、D組與A組比較，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P均＜0.05)，且D組凋亡率最高。這表明應(yīng)用熱療、順鉑及聯(lián)合治療后，均顯著增加了SCLC細(xì)胞的凋亡，且聯(lián)合治療的細(xì)胞凋亡率顯著高于單獨(dú)治療組。

Bcl－2 主要的生理功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，Bcl－2過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，使那些具有遺傳改變而又得不到修復(fù)的細(xì)胞免于死亡而進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡不平衡。Bax的作用與Bcl－2相反，對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。Bax基因過(guò)度表達(dá)可抑制 Bcl－2的功能，加速細(xì)胞凋亡［11］。許多細(xì)胞凋亡過(guò)程中都伴有Bax表達(dá)水平升高，轉(zhuǎn)染Bax可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡;Bcl－2過(guò)表達(dá)和Bax低表達(dá)，可使細(xì)胞凋亡受到抑制。Bcl－2和Bax的表達(dá)與肺癌患者的預(yù)后和生存期具有一定的相關(guān)性［12，13］。Bcl－2蛋白定位于線粒體外上，能阻滯細(xì)胞色素C的釋放，從而使Caspase活化受阻，腫瘤細(xì)胞凋亡受抑，最終導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生化療耐藥性。因此，Bcl－2既是一種抗凋亡基因，也是一種耐藥基因;降低Bcl－2基因的過(guò)度表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥性。已有研究［14］顯示，以 Bcl－2 為靶基因抑制其表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)SCLC產(chǎn)生的化療耐藥性。本研究結(jié)果顯示，B、C、D組NCI－H446細(xì)胞中 Bcl－2的表達(dá)水平明顯低于 A組，Bax的表達(dá)水平明顯高于A組，說(shuō)明熱療、順鉑均可降低SCLC細(xì)胞Bcl－2的表達(dá)、增強(qiáng)Bax表達(dá)，兩者聯(lián)合應(yīng)用可使該作用進(jìn)一步增強(qiáng)。其機(jī)制可能為熱療可以增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，使化療藥物更容易進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)，殺滅癌細(xì)胞;同時(shí)，熱療還通過(guò)抑制DNA修復(fù)和多藥耐藥性P－糖蛋白的表達(dá)［15］，來(lái)增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性、減少或逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的發(fā)生，使癌細(xì)胞更容易被殺傷，從而降低和逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生的耐藥性，對(duì)化療有成倍增效作用。這為我們應(yīng)用熱療和順鉑治療SCLC提供了一定的理論依據(jù)。

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