玉竹單體化合物對PC12細胞氧化損傷的保護作用

(山東省醫學科學院藥物研究所、山東省罕少見病重點實驗室，濟南250062)

中藥玉竹為百合科黃精屬植物玉竹的干燥根莖，味甘，微寒，臨床常用于治療肺胃陰傷、燥熱咳嗽、小便頻數等癥。此外，玉竹還具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤和提高機體免疫力等作用［1～3］。目前，對玉竹的研究多限制在其提取部位或多組分的藥理活性研究，而對其單一有效成分和藥理作用機制的研究報道較少。2011年11～12月，本實驗采用PC12神經細胞經氧自由基損傷和缺氧損傷為模型，觀察從玉竹中提取的兩個單體化合物4'，5，7-三羥基-6-甲基-8-甲氧基-高異黃酮(以下簡稱高異黃酮)和N-反式阿魏酸酪酰胺(以下簡稱阿魏酸酪酰胺)對神經細胞氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12神經細胞株購自中科院上海細胞庫。高異黃酮和阿魏酸酪酰胺由本所天然藥化室提供，經HPLC和NMR檢驗［4］純度均＞99%。準確稱取化合物各1 mg，分別加入50μL DMSO溶解，用含10%小牛血清的RPMI1640細胞培養液稀釋至作用終濃度分別為 1 ×10－4、2 ×10－5、4 ×10－6、8 ×10－7和1.6 ×10－7mol/L，無菌過濾備用。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取指數生長期PC12細胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液制成單細胞懸液，調整細胞密度為2×105/mL，按每孔100μL接種到96孔培養板內，于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，分別加入不同濃度的化合物，陽性對照組為三七總皂苷注射液(50μg/mL)，陰性對照組為相同體積的細胞培養液，每組設3個平行孔，繼續常規培養24 h。

1.2.2 PC12細胞氧自由基損傷和缺氧損傷模型的制備［5］分別取化合物作用后的細胞，自由基損傷模型加入H2O2，調整終濃度為1×10－4mol/L，繼續常規培養4 h;缺氧損傷模型加入Na2S2O4，調整終濃度為1×10－3mol/L，繼續常規培養12 h。

1.2.3 MTT比色法觀察化合物對PC12細胞經氧自由基損傷和缺氧損傷的保護作用 取上述細胞，每孔加10μL 0.5% 的 MTT，置5%CO2孵箱內孵育4 h。離心，傾去孔內液體，每孔加入200μL DMSO振搖10 min，使結晶充分溶解，于Victor1420多標記檢測儀上575 nm處測定各孔吸光度OD值，根據其OD值計算細胞存活率。存活率(%)=(供試品組OD/陰性對照組OD)×100%。

1.2.4 統計學方法 使用SPSS11.0統計軟件進行數據分析，率的比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

高異黃酮在濃度為1×10－4和2×10－5mol/L時，阿魏酸酪酰胺在濃度為 1 ×10－4、2 ×10－5、4 ×10－6和8×10－7mol/L時對PC12細胞氧自由基損傷具有明顯保護作用，細胞存活率明顯升高，并具有良好的劑量—效應關系，與模型組比較有統計學差異(P＜0.01或 ＜0.05)。此外，高異黃酮濃度為1×10－4mol/L時，阿魏酸酪酰胺濃度為 1 ×10－4、2 ×10－5mol/L時對PC12細胞缺氧損傷具有較好的保護作用，細胞存活率與模型組比較有統計學差異(P均＜0.05)。結果見表1。

表1 玉竹單體化合物對H2 O2、Na2 S2O4損傷PC12細胞的保護作用(%，±s)

表1 玉竹單體化合物對H2 O2、Na2 S2O4損傷PC12細胞的保護作用(%，±s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 H2 O2損傷細胞存活率Na2 S2O4損傷細胞存活率陰性對照組100.0 ±0.0 100.0 ±0.0模型組 59.0 ±2.2 71.1 ±3.5陽性對照組 69.6±2.6＊＊ 91.8±3.2*高異黃酮組1 ×10 －4 68.1 ±1.8＊＊ 84.4 ±3.9*2 ×10 －5 64.9 ±2.1* 78.9 ±2.5 4 ×10 －6 61.7 ±1.7 78.9 ±3.4 8 ×10 －7 60.1 ±2.4 73.3 ±2.5 1.6 ×10 －7 59.8 ±4.2 72.6 ±3.4阿魏酸酪酰胺組1 ×10 －4 72.4 ±2.6＊＊ 91.4 ±4.8*2 ×10 －5 69.8 ±4.4＊＊ 85.6 ±1.1*4 ×10 －6 67.4 ±3.0* 82.2 ±3.7 8 ×10 －7 65.2 ±1.4* 73.7 ±4.3 1.6 ×10－764.5 ±3.0 73.4 ±2.7

3 討論

中藥玉竹的化學提取成分主要包括甾體皂苷、黃酮、生物堿、多糖、甾醇、鞣質、黏液質和強心苷等［1］。我們在前期研究中，從玉竹的正丁醇提取物中分離得到18個化合物［4］，本文進一步分析玉竹中分離得到的含量較大、活性較好的兩種化合物高異黃酮和阿魏酸酪酰胺對PC12神經細胞氧化損傷的保護作用。高異黃酮屬于黃酮化合物中特殊的一類，母體結構較異黃酮多出一個碳原子。目前，黃酮類化合物的抗氧化性質已引起學者們的廣泛關注。章丹丹等［5］采用細胞學實驗和體外化學實驗相結合的方法綜合評價了桑枝總黃酮的抗氧化活性，結果表明桑枝總黃酮具有較強的自由基清除能力。張昕原等［6］研究了廣棗總黃酮對大鼠心肌細胞過氧化損傷的保護作用，發現廣棗總黃酮通過清除自由基，抑制脂質過氧化反應，維持心肌細胞膜結構和功能的完整性，從而對心肌起保護作用。黃酮類化合物抗氧化機理有兩大類:一類是絡合具有促氧化作用的金屬離子，另一類是清除自由基［7］。許多以黃酮類成分為主的制劑已作為成藥上市，如以葛根素為主的愈風寧心片可用于緩解高血壓癥狀，治療冠心病心絞痛等［8］;以銀杏葉總黃酮為主的天保寧是治療冠心病、心絞痛、心肌梗死、腦血栓等疾病的新藥，對冠心病合并高脂血癥患者具有降低血清總膽固醇、升高高密度脂蛋白的作用［9］。N-反式阿魏酸酪酰胺為阿魏酸酰胺類衍生物，阿魏酸具有抗血小板聚集、抗氧化、抗自由基、抗菌消炎、抗腫瘤、抗突變、增強免疫功能等多方面的生物活性［10］。作為公認的天然抗氧化劑，阿魏酸對H2O2、超氧自由基、羥自由基、過氧化亞硝基都有強烈的清除作用。此外，阿魏酸還能調節人體生理機能，抑制產生自由基的酶，促進清除自由基的酶的產生。據報道，阿魏酸能大大增加谷胱甘肽轉硫酶和醌還原酶的活性，抑制酪氨酸酶活性，并能與膜磷脂酰乙胺結合，保護膜脂不受自由基的侵襲［11］。本實驗顯示，N-反式阿魏酸酪酰胺體外對氧自由基損傷和缺氧損傷的神經細胞均具有良好的保護作用，這可能是中藥玉竹抗氧化作用的物質基礎之一，進一步研究其保護作用機理，對于新藥開發和臨床心腦血管疾病的治療均具有積極的意義。

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