HPLC-MSMS法快速鑒定Z/E馬來酸桂哌奇特異構體

陳俊苗， 朱登勇， 王少敏， 張 凱， 李翠萍， 劉宏民

(1.鄭州大學 化學與分子工程學院 河南 鄭州 450052；2.鄭州大學 藥學院 河南 鄭州 450001)

0 引言

隨著藥物構效關系研究的深入，藥物異構體的分離分析日益被人們重視.高效液相色譜串聯質譜法(HPLC-MSMS)集合液相色譜的高分離能力和質譜的高靈敏度、高分辨能力于一體，是進行同分異構體檢查和藥物降解產物分析鑒定的強有力分析工具之一[1-3].馬來酸桂哌奇特(cinepazide maleate)是一種新型的治療心腦血管疾病的藥物(結構式見圖1(a))，是一種鈣離子通道阻滯劑，同時具有對腺苷、cAMP增效的生物學作用[4].在馬來酸桂哌奇特的合成及儲存過程中，總伴隨有部分Z型異構體雜質(圖1(b))的生成[5]，但到目前為止分離檢測其Z/E型異構體的報道很少，且檢出時間較長[6].由于Z型異構體價格昂貴且不易購得，并且對照兩個分離峰的紫外色譜圖也不足確證它們為一組Z/E異構體.而采用HPLC-MSMS技術，通過對其E型主成分及其Z型異構體雜質的色譜和質譜分析，可以在無對照品的情況下，對雜質進行快速確認，并確保方法的可靠性.

圖1 E型馬來酸桂哌奇特主成分(a)及Z型異構體雜質(b)的結構式Fig.1 Structures of E cinepazide maleate(a) and its Z isomer impurity (b)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Micromass Q-Tof MicroTM高分辨質譜儀(美國Waters公司)；Alliance HPLC 系統(美國Waters公司)：(1) 2695分離單元;(2) 2996光電二極管陣列檢測器，Waters MasslynxTM4.0軟件系統.馬來酸桂哌奇特原料藥及E型、Z型對照品(鄭州大學新藥研發中心提供).乙腈為色譜純，乙酸銨、乙酸為分析純，18.2 MΩ超純水.

1.2 液相色譜/質譜條件

Spherisorb C18柱(5 μm, 4.6 mm×200 mm) (天津市蘭博實驗儀器設備有限公司)；流動相：乙腈/乙酸銨緩沖溶液(稱取無水乙酸銨0.70 g和冰乙酸0.15 g，加水至1 L，搖勻，pH=4.0) (20∶80, V /V );進樣體積為10 μL；柱溫為30 ℃；流速為1 mL /min (柱后分流80%)；檢測波長254 nm.

電噴霧離子源(ESI)；正離子模式；毛細管電壓為3 000 V；錐孔電壓為30 V；源溫為80 ℃；干燥氣溫度為180 ℃；碰撞活化裂解(CAD)電壓為17 V；碰撞氣為Ar；掃描范圍為m/z50～600.

1.3 測試溶液的制備

馬來酸桂哌奇特原料藥首先在紫外燈下照射40 h，然后精確稱取1 mg用100 mL流動相定容后作為供試品溶液.

2 結果與討論

取1.3節制備的供試液按1.2節條件進行HPLC-MSMS分析，通過對樣品進行全掃描獲得樣品的總離子流圖(TIC)及提取離子流圖(EIC)(圖2).

圖2 E型桂哌奇特(Ⅱ)及其Z型異構體(Ⅰ)的提取離子流圖(A)和總離子流圖(B)，Z型異構體中m/z 418的二級質譜(C)和E型桂哌奇特中m/z 418的二級質譜(D)Fig.2 The corresponding extract ion chromatogram(A) and total ion chromatogram(B) of E cinepazide maleate( Ⅱ) and Z cinepazide maleate( Ⅰ )，MS/MS spectra of m/z 418 of Z cinepazide maleate in raw drugmaterial (C) and m / z 418 of E cinepazide maleate (D)

從供試品溶液總離子流圖中提取m/z418離子得到保留時間分別為4.68 min和5.82 min的兩個譜峰.分別對其積分處理發現它們的準分子離子峰分別為m/z418.234 3和m/z418.234 0 (C22H32N3O5)，表明兩者為桂哌奇特同分異構體.采用標樣對比法對E型桂哌奇特主成分進行確認，可知圖2(A)和(B)中5.82 min處的譜峰為E型桂哌奇特(主成分).為進一步獲得異構體的結構信息，選擇主成分和異構體雜質產生的準分子離子m/z418進行碰撞活化分解(CAD)得到結果如圖2(C)和(D).由圖可見：在相同質譜條件下(注：裂解電壓為17 V)，兩者產生的主要碎片均有m/z319.2，m/z221.1，m/z198.2，m/z99.1；E型桂哌奇特主成分和Z型雜質裂解峰中m/z99.1和m/z319.2的碎片豐度基本一致，而m/z198.2和m/z221.1的相對豐度卻差異很大:雖然雜質和主成分的MSMS質譜圖中碎片峰m/z221.1均為基峰，但雜質中豐度為96%的碎片峰m/z198.2在主成分譜圖中僅為53%.推測是因為E型桂哌奇特中雙鍵一端羰基的氧原子和雙鍵另一端的氫原子在雙鍵的同側易形成分子內氫鍵(裂解途徑見圖3)，形成一個五元環過渡態從而使主成分中m/z221.1碎片離子較穩定，以致其相對豐度可達到碎片離子m/z198.2的2倍，而Z型雜質中雙鍵一端的羰基和另一端的氫原子處于反位不易形成這種過渡態使得兩個碎片的離子穩定性相當，因此兩碎片的豐度也相近.采用標樣對比法對Z型雜質進行確認也與此結果相吻合，從而證實了本文的推斷.

圖3 E型桂哌奇特的裂解過程Fig.3 Cleavage processes of E cinepazide

3 結論

研究結果表明，E型桂哌奇特主成分及其Z型異構體雜質由于空間結構的不同，導致其裂解方式和二級質譜圖也不同，可據此將兩者加以區分.應用所建立的HPLC-MSMS法能使Z/E馬來酸桂哌奇特異構體在沒有標樣的情況下快速準確地分離和鑒定.

參考文獻：

[1] Ermer J, Vogel M. Applications of hyphenated LC-MS techniques in pharmaceutical analysis[J].Biomed Chromatogr, 2000, 14 (6): 373-383.

[2] Wang S M, Bu S S, Liu H M, et al. Separation and characterization of clindamycin phosphate and related impurities in injection by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2009, 23(6): 899-906.

[3] 蘇永恒，張榕杰，冶保獻. 固相萃取-超高效液相色譜-質譜法測定蔬菜、水果中多菌靈[J]. 鄭州大學學報：醫學版，2010，45(3)：490-493.

[4] 張曉霞，韓培紅. 馬來酸桂哌奇特的藥理作用及臨床應用研究[J]. 中國藥房，2007，18(26)：2060-2062.

[5] 劉華祥. 馬來酸桂哌齊特的制備及其光致順反異構體研究[D]. 大連:大連理工大學, 2009.

[6] 許晉星. RP-HPLC法測定馬來酸桂哌齊特片中有關物質的含量[J]. 中國藥房，2009，20(1)：59-60.